[发明专利]一种中药单体及高表达重组人骨形态发生蛋白细胞凝胶制剂及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种中药单体及高表达重组人骨形态发生蛋白细胞凝胶制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）BMP-2/BMP-6基因腺病毒载体的构建：

用聚合酶链反应方法扩增骨形态发生蛋白-2（BMP-2）和骨形态发生蛋白-6（BMP-6）的目的基因，并插入载体pMD19-T Simple Vector中进行测序分析，将BMP-2和BMP-6基因亚克隆到穿梭载体pEC3.1中，构建pEC3.1-BMP-2和pEC3.1-BMP-6穿梭质粒，再将其中的表达盒通过重组克隆到pAd/BLOCK-iTTM-DEST腺病毒载体中，线性化后转293细胞进行包装，获得重组腺病毒rAd-BMP-2和重组腺病毒rAd-BMP-6；

2）重组腺病毒rAd-BMP-2、rAd-BMP-6与人骨髓基质干细胞（BMSCs）的电转染：

取人BMSCs 5×10⁶个，PBS冲洗，用电转缓冲液重悬细胞，加入15μg重组腺病毒rAd-BMP-2或重组腺病毒rAd-BMP-6，混匀后注入电转杯中，冰浴，进行电转染，得到高表达重组人骨形态发生蛋白间充质干细胞；将高表达重组人骨形态发生蛋白间充质干细胞转移至预置灭菌盖玻片的培养板中，加入LG-DMEM全培养基，在37℃、5%CO₂、湿度饱和的培养箱中培养；

3）将高表达重组人骨形态发生蛋白间充质干细胞加入生理盐水中，再加入中药单体物质，混合均匀，得到细胞悬液；所述中药单体物质为姜黄素和薯蓣皂苷元；

4）将青霉素、糖皮质激素、人血白蛋白、甘露醇和透明质酸钠混合，得到凝胶溶液，将细胞悬液注射入含有凝胶溶液的无菌容器中，混合均匀，得到pH值为7.25~7.45的中药单体及高表达重组人骨形态发生蛋白细胞凝胶制剂，无菌分装，封口，0~4℃保存。

2.根据权利要求1所述的中药单体及高表达重组人骨形态发生蛋白细胞凝胶制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中设置电转染参数为电压240V、脉冲时间1s、脉冲4次、脉冲间隔5s。