[发明专利]一种长片段DNA分子结构柔性的表征方法有效
| 申请号： | 202110333527.6 | 申请日： | 2021-03-29 |
| 公开（公告）号： | CN113088567B | 公开（公告）日： | 2023-06-13 |
| 发明（设计）人： | 宋波;吴珍;程时锋 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院农业基因组研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/6855 | 分类号： | C12Q1/6855;C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 深圳市韦恩肯知识产权代理有限公司 44375 | 代理人： | 李华双 |
| 地址： | 518000 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 片段 dna 分子结构 柔性 表征 方法 | ||
1.一种长片段DNA分子结构柔性的表征方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将长片段DNA分子随机片段化为短片段DNA分子；
(2)将步骤(1)得到的短片段DNA分子的两端分别连接接头序列；
(3)将步骤(2)得到的带有接头的DNA分子进行限制性内切酶酶切，产生黏性末端；
(4)使用连接酶对步骤(3)得到的带有黏性末端的DNA分子进行环化连接；
(5)根据步骤(2)得到的短片段DNA分子中的接头序列设计相向延伸引物对和背向延伸引物对，采用相向延伸引物对和背向延伸引物对分别对步骤(4)得到的DNA分子进行荧光定量PCR，得到背向延伸引物对荧光定量结果和相向延伸引物对定量结果；
(6)计算步骤(4)得到的DNA分子环化效率，通过步骤(4)得到的DNA分子环化效率来表征长片段DNA分子结构柔性，DNA分子环化效率为步骤(5)得到的背向延伸引物对荧光定量结果与相向延伸引物对定量结果之比，如计算得到的DNA分子环化效率越高，则长片段DNA分子结构柔性越高。
2.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(1)中长片段DNA分子长度为1000～2100bp。
3.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(1)中片段化方法为酶切法或物理方法。
4.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(1)中短片段DNA长度为50～100bp。
5.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(1)中将短片段DNA分子末端补平。
6.根据权利要求5所述的表征方法，其特征在于，所述末端补平采用T4 DNA聚合物、Taq酶或Klenow片段进行。
7.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(3)中将短片段DNA分子回收后稀释至0.05-0.15pmol/ml。
8.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述接头序列包括5’端接头和3’端接头，所述5’端接头的序列如SEQ ID NO:7所示，所述3’端接头的序列如SEQ ID NO:8所示。
9.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(4)中连接酶为T4连接酶。
10.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(4)中环化反应时间为5-10分钟。
11.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述步骤(6)中相向延伸引物对包括如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的序列，背向延伸引物对包括如SEQ ID NO:11和SEQID NO:12所示的序列。
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