[发明专利]饲料中斑蝥黄的测定方法

说明书

本发明公开一种饲料中斑蝥黄的测定方法。试样中斑蝥黄经水分散、乙醇和二氯甲烷提取，配合饲料和浓缩饲料的提取液用HLB小柱净化，添加剂预混合饲料的提取液则直接稀释。试样经反相高效液相色谱仪分离，外标法定量试样中全反式斑蝥黄和顺式斑蝥黄的总量。该方法能够满足饲料中斑蝥黄顺反异构体的快速、准确测定需要。

技术领域

本发明涉及一种饲料中斑蝥黄的测定方法。

背景技术

斑蝥黄又称角黄素、斑蝥黄质（Canthaxanthin），是一种重要的类胡萝卜素类红色色素，化学结构式见图1，化学名称为β，β—胡萝卜素—4，4—二酮，主要有全反式（图1）和顺式（图2）异构体。天然的斑蝥黄存在于水果、蔬菜、蘑菇、藻类、蛋、甲壳类动物和各种鱼中。斑蝥黄可通过微生物培养或化学合成进行生产，因其分子中存在共轭双键结构，稳定性差，对氧气、氧化剂、热和湿都十分敏感，在产品生产、保存和销售过程中必须进行保护，常用的方法是将其进行微囊包被，制成各种规格的水溶性预混剂。1984年FDA/WHO批准斑蝥黄列入食品添加剂并制定了质量标准。在饲料方面，斑蝥黄用作鱼类和禽类饲料的着色剂，以增强鱼类肉体的颜色和禽类皮肤的颜色以及蛋黄的颜色。2013年我国饲料添加剂目录规定斑蝥黄仅适用于家禽。就像其他类胡萝卜色素一样，它是一种有效的抗氧化剂，但是摄取过量的斑蝥黄则可能在动物和人的视网膜上沉积，导致视觉问题。为此，2003年英国对于肉禽和蛋禽饲料中斑蝥黄的添加量予以规定，在肉禽和蛋禽配合饲料中添加量分别不超过25 mg/kg和8 mg/kg。2017年我国农业农村部也做出了同样的限制（农业农村部公告第2625号）。

目前，关于斑蝥黄的检测，主要有分光光度计法、薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）等。王云全等制定了关于饲料添加剂斑蝥黄的国家标准（GB/T 18970-2003），用水、无水乙醇和三氯甲烷混合溶液水浴超声提取试样中的斑蝥黄后，再采用分光光计法对其定量；Tolass等建立了测定鲑鱼中斑蝥黄含量的方法，先使用丙酮溶液对斑蝥黄进行萃取，再经装填硅胶的玻璃柱对样品进行脱脂处理。使用丙酮-正己烷混合溶液作为展开剂，用TLC法定量分析斑蝥黄；农业农村部标准NY/T 2896-2016建立了饲料中斑蝥黄测定的HPLC法，试样中斑蝥黄经无水乙醇和二氯甲烷提取，经氮气保护浓缩后复溶，正相HPLC分离，紫外检测器检测，外标法测定斑蝥黄的含量；国家标准GB/T 22958-2008 建立了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中斑蝥黄残留量测定的HPLC-MS法，该方法使用乙腈提取试样中的斑蝥黄，并用正己烷进行脱脂、净化处理，HPLC-MS检测，外标法定量。

上述斑蝥黄定量方法中，分光光度计法操作简单，成本较为低廉，但是其测定的浓度范围十分有限，仅适用于添加量为10%及以上以喷雾法工艺制造的斑蝥黄饲料添加剂，而TLC法操作步骤繁多，较为复杂，重复性较差。HPLC-MS法测定试样中斑蝥黄，具有结果准确可靠、回收率和精密度好等优点，但HPLC-MS仪器贵重，在普通的饲料厂和养殖场不能普及。HPLC法是测定类胡萝卜素最常见的方法，该方法简便、快速、准确、重复性好，能够满足检测机构在实际检测中的定性和定量要求。

现行标准NY/T 2896-2016（饲料中斑蝥黄的测定高效液相色谱法）在实验过程中采用甲苯配制标准品，采用丙酮、二氯甲烷等有机溶剂对饲料样品中的斑蝥黄进行提取，并应用正相HPLC法分析。

发明内容

针对现有饲料中斑蝥黄定量分析斑蝥黄提取不完全、纯化步骤缺乏或过于复杂、定量时忽略顺式斑蝥黄含量等系列问题，本发明的目的是提供饲料中斑蝥黄的测定方法。