[发明专利]一种高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及使用方法

说明书

本发明公开了一种高灵敏新型冠状病毒2019‑nCoV核酸检测试剂盒及使用方法，包括ORF1ab基因引物对、N基因引物对、内标基因引物对及探针组，本发明以新型冠状病毒（2019‑nCoV）ORF1ab和N基因为靶区域，设计特异性引物及探针，通过检测荧光信号的变化，对样本中的新型冠状病毒2019‑nCoV核酸进行定性检测，由于ORF1ab基因探针、N基因探针的5’端用荧光基团FAM修饰后成为单色双靶检测体系，并使用高于常规的大体积体系进行扩增，在对新型冠状病毒2019‑nCoV核酸检测时，检测灵敏度高，灵敏度高可达可以到50copies/mL，而且以正常人上皮细胞中广泛存在的核糖核酸酶P（RNase P,RNP）基因作为内标靶基因，对核酸提取和检测过程进行监控，避免了假阴、假阳性的产生，因此在市场推广前景广阔。

技术领域

本发明涉及生物学检测技术领域，特别是一种高灵敏新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及使用方法。

背景技术

2019-nCoV主要传播途径为经呼吸道飞沫传播，以呼吸道分泌物排出体外，经口液、喷嚏传染，亦可通过接触传播。感染新冠病毒后潜伏期在3-7天，一般不超过14天，临床表现以发热乏力、干咳为主，鼻塞流涕等上呼吸道症状少见，约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者进展为急性呼吸窘迫综合征、休克、难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。

冠状病毒为单链RNA病毒，属于巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)，正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinac)，根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ、δ4个属，已知感染人的冠状病毒有6种，包括α属的冠状病毒(HCoV-229E和HCoV-NL63)和β属的冠状病毒(HCoV-HKU1、HCoV-OC43、MERS-CoV和SARS-CoV)，2019-nCoV为β属的新型冠状病毒。

2019-nCoV具有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，经常为多形性，直径60-140nm。病毒基因组5’端具有甲基化的帽状结构，3’端具有poly(A)尾，基因组全长约27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒全基因组通常含有7个开放阅读框，每相邻两基因之间存在间隔序列，5’端为非编码区帽子结构，3’端为多聚腺苷酸非编码区；从5’端起约占据全基因组的三分之二的ORF1(包含ORF1a和1b)也称为复制酶基因，负责编码16个以上与病毒复制相关的非结构蛋白；靠近3’端的4个开放阅读框，依次编码S蛋白(spikeprotein)、E蛋白(envelope protein)、M蛋白(membrane protein)和N蛋白(nucleoprotein)。冠状病毒S蛋白位于病毒表面形成棒状结构，是用于分型的主要基因。N蛋白包裹病毒基因组可用作诊断抗原。

各研究机构及生物公司都致力于相关核酸检测试剂盒的开发和生产，经过半年多的使用发现，目前市场上的2019-nCoV核酸检测试剂盒，患者在早期感染阶段存在漏检情况。“根据天津疾控中心1月30日公布的新增确诊案例情况显示，天津疾控第28例患者，男，55岁，与本单位多名新型冠状病毒感染的肺炎患者为密切接触者。1月19日出现发热，1月25日就诊于市第四中心医院，两次核酸检测阴性，予以居家隔离。1月27日再次发热，1月28日核酸检测阴性，1月30日第四次检测为阳性”。上述案例的出现说明一部分早期感染的患者在体液中病毒载量低，虽然用现有的检测试剂盒多次检测结果为阴性，但是仍然是病毒感染者且具有感染性。而这类患者的漏检很可能造成周围人群进一步的感染，不利于病毒传播的控制。申请号为202010160474.8的中国发明专利，公开了一种新型冠状病毒N基因核酸检测试剂盒，采用N基因特异引物和Taqman探针，结合特异的内标引物、探针体系监控样本提取、检测过程，实现对2019-nCoV N基因的检测。申请号为202010160162.7的中国发明专利，公开了一种新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒用ORF1ab基因特异引物和Taqman探针，结合特异的内标引物、探针体系监控样本提取、检测过程，实现对2019-nCoV ORF1ab基因的检测。但上述方法分别对不同靶基因进行检测，而且现有方法的检测体系小，模板加样量小，检测灵敏度不足，因此仍然存在漏检的问题。