[发明专利]一种高产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株高产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌菌株，并提供了其在普鲁兰酶生产中的应用。所述枯草芽孢杆菌是通过紫外诱变方法筛选获得的普鲁兰酶产量显著提高的突变菌株，保藏编号为CGMCC No.19498。所述菌株可广泛应用于普鲁兰酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术

普鲁兰酶(pullulanase,EC 3.2.1.41)属于α-淀粉酶第13家族，是一种可以特异地水解普鲁兰多糖、淀粉及相关分支多糖中α-1，6-糖苷键的一种脱支酶。经研究发现，大部分淀粉质原料含有75％-85％的支链淀粉，支链淀粉中含有4％-5％的α-1,6-糖苷键。由于它对α-1，6糖苷键的特异水解功能，普鲁兰酶被广泛地应用于淀粉糖加工工业、医药领域、饲料、啤酒及白酒酿造等工业中。

1961年，Bender和Wallenfels首次通过产气气杆菌Aerobacter Aerogenes发酵获得普鲁兰酶。迄今，已报道的产普鲁兰酶的菌种还有很多，例如克雷伯氏菌属的Klebsiellaaerogenes、链球菌属的Streptococcus pneumoniae、链霉菌属的Streptomycesflavochromogenes、火球菌属的Pyrococcus woesei、芽孢杆菌属的Bacillusflavocaldarius、热球菌属的Thermococcus hydrothermalis、厌氧分支杆菌属的Anaerobranca gottschalkii等。尽管已发现许多产普鲁兰酶的微生物，但大多数野生菌种因为生存环境要求高、所产酶的活性低或者酶学性质不稳定等因素，没有太大的商业利用价值。因此目前已经投入到普鲁兰酶工业化生产中的菌株，只有丹麦Novo公司的Bacillusacidopullulyticus和美国Genencor公司的Bacillus deramificans等少数几个菌。

由于目前从自然界分离到的天然菌株，分泌普鲁兰酶的能力很低，不能满足工业生产的需求。而工业用普鲁兰酶由于异源表达菌株的分泌性能较差，产酶效率过低等因素，又极大地限制了我国普鲁兰酶的规模化工业生产。为解决这些问题大致有两条途径：一是，通过传统的遗传学方法对已有的菌株进行改良以获得性能更优良的菌株；二是，通过基因工程的手段克隆性能优良的普鲁兰酶基因并将其导入到合适的宿主体内得到优良的重组菌。例如，2008年Zouari等人使用来源于嗜热脂肪芽孢杆菌US100(B.stearothermophilusUS100)α-淀粉酶和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)脂肪酶的信号肽研究了地芽孢杆菌(Geobacillus thermoleovorans)US105普鲁兰酶编码基因在大肠杆菌中的高效表达。2011年Kang等人将来自于新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)中的普鲁兰酶编码基因连同信号肽序列克隆到大肠杆菌中，在T7启动子的控制下，实现了该酶在大肠杆菌中的成功表达。2017年李金良等从云南腾冲热泉附近的土壤样品中筛选得到一株产中温普鲁兰酶的解淀粉芽孢杆菌。通过蛋白质电泳和N端测序技术分析普鲁兰酶N端组成，分析基因组数据得到中温普鲁兰酶的基因并将该基因以整合到枯草芽孢杆菌基因组的方式在枯草芽孢杆菌中表达，得到较原始菌株酶活有极大提高的重组菌株。

目前现有的产普鲁兰酶的菌株仍不能满足工业化生产的需要，产量仍偏低，导致该酶的成本居高不下，因此开发新的普鲁兰酶高产菌株迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌菌株，并提供了其在普鲁兰酶生产中的应用。申请人首先构建得到重组表达普鲁兰酶基因的枯草芽孢杆菌菌株，然后进一步对其进行紫外诱变，筛选获得普鲁兰酶产量显著提高的突变菌株，从而有利于降低该酶的生产成本，促进普鲁兰酶的广泛应用。

本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌工程菌株，其携带有表达普鲁兰酶的重组质粒。