[发明专利]一种CD3抗原的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种CD3抗原的制备方法及应用，所述抗原为由质粒A和质粒B通过共表达形成的二硫键链接的异二聚体，其中，质粒A包含CD3D胞外区、Linker1及C端Acidic Tail和6His tag，质粒B包含CD3E胞外区、Linker2及C端Base Tail。本发明采用在CD3不同亚基上分别融合表达一组小标签Acidic Tail和Base Tail的方法，可以提高异源二聚体比例且有利于异源二聚体的稳定，融合标签小，对蛋白影响小，制备便捷，并通过his一步亲和提纯，二聚体比例HPLC纯度达到95%以上，并与CD3抗原抗体UCHT1展示出较好的亲和力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CD3抗原的制备方法及应用。

背景技术

CD3蛋白是一种T细胞标志物，仅在T细胞中发现。在恶性淋巴瘤中，CD3是一种广泛的T细胞系限制性抗原，在80%～97%的T细胞淋巴瘤中能被检测到。CD3是恶性淋巴瘤和淋巴样白血病分类的重要标志物。

CD3在T淋巴细胞表面通过与T细胞受体（TCR）形成复合物来发挥信号传递作用，当抗原呈递细胞（APC）激活TCR时，TCR介导的信号通过CD3链CD3D，CD3E，CD3G和CD3Z跨细胞膜传输，而TCR-CD3复合体组装则是通过形成CD3D / CD3E和CD3G / CD3E两个异二聚体来启动的。除了信号转导在T细胞活化中的作用外，CD3E在正确的T细胞发育中也起着至关重要的作用。因此制备CD3不同亚基的两个异源二聚体对CD3与TCR的相互作用以及该信号传导在免疫应答中的分子机制研究非常重要，CD3不同亚基异源二聚体作为靶点蛋白成为研究热点，CD3的抗体靶向药物通常通过识别形成天然异源二聚体的CD3E，从而激活T细胞，使其行使肿瘤杀伤功能。然而，在体外重组表达制备 CD3E/CD3D，CD3E/CD3G异源二聚体蛋白的过程中，CD3E与CD3D或CD3G极易形成单体比例不均一的复合物，无法保证异源二聚体蛋白的结构和功能，并造成较大批间差异，是双抗药物开发的瓶颈。

现有技术有通过原核大肠杆菌表达系统表达单个亚基后进行等比例混合复性，得到二聚体，但是该方法相对哺乳表达系统制备的CD3抗原免疫活性低；目前通过真核哺乳细胞表达CD3不同亚基，多采用融合FC标签（野生型或者突变体）的方式帮助形成二聚体，但是由于FC标签本身能形成二聚体，融合野生型FC标签的方法容易引起同源二聚体的干扰、有异源二聚体比例低需多步骤纯化的缺点；融合突变体FC标签蛋白虽然能有效降低同源二聚体比例，但是也存在易于形成高聚体的问题，另外FC标签分子量较大，对目标蛋白构象、功能的影响尚无明确报道，且融合突变体FC标签对最终蛋白的ADCC效应是否有影响也尚未明确，同时在抗体药开发中也会因标签的相似性而造成检测的不便。

发明内容

为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种CD3抗原的制备方法及应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供一种CD3抗原，所述抗原为由两个质粒共转形成的异二聚体，第一个质粒为CD3D胞外区通过Linker1融合Acidic Tail及C端6*His构成质粒A，第二个质粒为CD3E胞外区通过Linker2融合Base Tail构成质粒B；

其中，CD3D胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；CD3E胞外区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；Acidic Tail的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；Base Tail的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；Linker1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；Linker2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；6*His的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

作为本发明的一种优选技术方案，本发明还提供一种CD3抗原的制备方法，包括以下步骤：

S1、CD3抗原不同亚基表达载体的构建：