[发明专利]猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗制备及鉴定方法

说明书

本发明公开了一种猪带绦虫Ts14‑3‑3.3 DNA疫苗制备及鉴定方法，属于基因工程疫苗技术领域，包含以下步骤：1）采用PAS法，全基因合成Ts14‑3‑3.3和sp‑Ts14‑3‑3.3；2）将目的基因克隆至真核表达载体，转入克隆菌株，挑取阳性克隆子测序鉴定和双酶切鉴定重组质粒；3）随后制备两种转染级别质粒，并分别转染人293F胚肾细胞，采用Western blot法鉴定；4）然后将小鼠分成4组；5）于首次免疫后0w、2w、4w、6w、8w收集小鼠血清和脾淋巴细胞进行鉴定。本发明成功制备了猪带绦虫pMZ‑X3‑Ts14‑3‑3.3和pMZ‑X3‑sp‑Ts14‑3‑3.3两种DNA疫苗。实现了猪带绦虫Ts14‑3‑3.3蛋白在人293F胚肾细胞中的表达。猪带绦虫pMZ‑X3‑Ts14‑3‑3.3和pMZ‑X3‑sp‑Ts14‑3‑3.3两种DNA疫苗均可诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答。

技术领域

本发明涉及基因工程疫苗技术领域，具体为一种猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗制备及鉴定方法。

背景技术

猪带绦虫又称猪肉绦虫、有钩绦虫，是一种主要的人体寄生绦虫。古代医籍中称之为寸白虫或白虫。猪带绦虫病是由猪带绦虫成虫寄生在人体小肠所引起的一种肠绦虫病，又称猪肉绦虫病、链状带绦虫病。人在猪带绦虫生活史中既是终宿主也是中间宿主。猪带绦虫成虫寄生在人肠道为肠猪带绦虫病，其幼虫寄生在人皮下组织、肌肉、脑等组织器官内则为猪囊尾蚴病(囊虫病)。囊虫病是人重要寄生虫病之一。

根据有关研究，猪带绦虫Ts14-3-3蛋白中Ts14-3-3.3亚型在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达，进而利用该蛋白作为囊虫病的诊断和疫苗研究可能具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于利用猪带绦虫Ts14-3-3蛋白，提供一种猪带绦虫Ts14-3-3.3DNA疫苗制备及鉴定方法。

为达到上述目的，采用的技术方案为：

本研究在前期验证猪带绦虫Ts14-3-3蛋白中Ts14-3-3.3亚型在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达的基础上，进一步采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)法，全基因合成Ts14-3-3.3和sp-Ts14-3-3.3抗原编码基因。分别将目的基因克隆至真核表达载体pMZ-X3，转入Top10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序鉴定和双酶切鉴定重组质粒pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3。随后制备两种转染级别质粒，并分别转染人293F胚肾细胞，采用Western blot法鉴定。然后将84只雌性Balb/c小鼠随机分成4组，分别为pMZ-X3-Ts14-3-3.3疫苗组；pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3疫苗组；pMZ-X3空质粒对照组；PBS空白对照组。于首次免疫后0w、2w、4w、6w、8w收集小鼠血清和脾淋巴细胞进行鉴定：①采用间接ELISA法检测血清中特异性IgG及其IgG1和IgG2a亚类水平；②采用CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖水平；③采用流式细胞术检测脾脏T淋巴细胞CD4⁺和CD8⁺亚群比例；④采用双抗夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平。

采用上述方案的有益效果为：这种猪带绦虫Ts14-3-3.3 DNA疫苗制备及鉴定方法具有以下成果：

1.成功构建了猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3重组质粒。2.成功制备了猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3两种DNA疫苗。3.成功实现了猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白在人293F胚肾细胞中的表达。4.猪带绦虫pMZ-X3-Ts14-3-3.3和pMZ-X3-sp-Ts14-3-3.3两种DNA疫苗均可诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答，且后者免疫效果优于前者。

附图说明

图1为本发明重组质粒构建模式图。