[发明专利]高特异性Taq DNA聚合酶变体及其在基因组编辑和基因突变检测中的应用

说明书

本发明提供高特异性Taq DNA聚合酶变体及其在基因组编辑和基因突变检测中的应用，属于生物技术领域。本发明通过对野生型全长Taq DNA聚合酶进行了半理性的定向分子进化来提高其特异性。选取Taq酶上与引物/模板复合物有直接相互作用的全部极性氨基酸进行逐个突变，获得40个Taq变体，然后在这些变体及野生型序列的基础上进行广泛的随机诱变，生成Taq突变体文库。在我们的qPCR筛选系统上，以基因组编辑indels质粒为模板，筛选出一系列具有高特异性的Taq突变体，在CRISPR/Cas9编辑效率评估和单细胞克隆基因分型中展现出了极大的优势，因此具有良好的实际应用之价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及高特异性Taq DNA聚合酶变体及其在基因组编辑和基因突变检测中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

CRISPR/Cas9技术能够仅通过一小段引导RNA在特定位点进行便捷的基因组编辑，现已广泛应用于功能基因组学研究，并在涉及遗传变异的疾病治疗中具有巨大潜力。目的基因组修饰主要有三种类型，包括由于双链断裂导致的易错非同源末端连接(NHEJ)修复，该修复会引起indels随机突变；使用DNA模板进行同源介导的修复(HDR)或直接通过碱基编辑引起的精确碱基改变；以及通过招募转录因子或染色质修饰因子进行基因调控。对于基因组编辑应用，通常需要评估给定CRISPR靶标的编辑效率，并在某些情况下，对获得的单细胞克隆进行基因分型。目前已经开发了几种方法，包括GEF-dPCR，getPCR和(ACT-PCR)，它们可在PCR扩增过程中将发生编辑修饰的DNA与野生型序列区分开。但由于Taq酶或TaqMan探针对DNA突变的鉴别能力有限，实验需要仔细优化才能得到较为准确的结果。使用修饰的荧光探针或使用比野生型Taq酶具有更好的错配选择能力的增强型DNA聚合酶变体，都可以提高PCR检测的准确性。DNA聚合酶变体能在不需要任何探针或引物修饰的情况下进行可靠的遗传变异检测，因此是提高基因变异检测准确度最经济有效的策略。

聚合酶与引物/模板双链DNA在小沟处的相互作用对于复制起始复合物的组装至关重要，然而，这些相互作用力是高度冗余的，超过了有效DNA复制起始的最低需求，取代这些氨基酸以破坏相应的相互作用可以提高错配延伸中DNA聚合酶的选择性。基于此原理的DNA聚合酶理性进化主要集中在基序C中少数几个极性氨基酸和碱性氨基酸的替换上，比如，在12个氨基酸位点处进行功能突变并通过对分子改组产生的组合文库中进行筛选，鉴定出了选择性提高的Taq变体。但是，所有这些DNA聚合酶突变体的理性设计都是以提高3‘末端单核苷酸错配延伸选择性为出发点的。然而，基因组编辑导致的插入缺失突变在很大程度上是复杂的以及不可预测的，这导致PCR检测引物和含有indel基因组DNA之间的错配类型也是极其多样化的。因此，基因组编辑研究非常需要一种新的DNA聚合酶变异体，它具有更好的识别基因组修饰引起的引物-模板错配的能力，该Taq变体将使基因组编辑频率检测和单细胞克隆基因分型等实验更加准确和方便。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供高特异性Taq DNA聚合酶变体及其在基因组编辑和基因突变检测中的应用。对野生型全长Taq DNA聚合酶进行了半理性的定向分子进化来提高其特异性。选取Taq酶上与引物/模板复合物有直接相互作用的全部极性氨基酸进行逐个突变，获得40个Taq变体，然后在这些变体及野生型序列的基础上进行广泛的随机诱变，生成Taq突变体文库。在我们的qPCR筛选系统上，以基因组编辑indels质粒为模板，筛选出一系列具有高特异性的Taq突变体，在CRISPR/Cas9编辑效率评估和单细胞克隆基因分型中展现出了极大的优势，因此具有良好的实际应用之价值。

具体的，本发明涉及以下技术方案：