[发明专利]从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法

权利要求书

1.从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤，

A1、获取周龄16～40周小鼠的结肠，经清洗、剪碎后置于离心管中，加入细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后进行涡旋混匀；

A2、去除上清液，再加入细胞解离液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后再次涡旋混匀，得到第一混合液；

A3、将再次涡旋混匀后的第一混合液去除上清液，将结肠转移到0～5℃的PBS溶液中，加入细胞消化液、0.3～0.5mol/L的氢氧化铁和0.1～0.2mol/L的氢氧化铝组成的混合溶液，在摇床上于37℃搅拌孵育20～30分钟后利用80mm滤网进行初滤，得到第二混合液；

A4、对第二混合液用100μm滤网进行过滤，将结肠加入HBSS中离心，然后去除上清液之后，再加入HBSS重悬，并加入壳聚糖包覆改性羰基铁，旋转摇动得到第三混合液，对第三混合液使用60～80μm金属过滤网过滤，在过滤过程中对过滤网通2～5mA的微弱电流，得到过滤液；

A5、将步骤A4得到的过滤液离心，然后用44％的第一Percoll液重悬后移至底部铺有67％的第二Percoll液的离心管，800×g离心10～20分钟；

A6、取中间层细胞收集，再次离心，收集沉淀；

A7、用稀释后抗体混悬步骤A6所得的细胞团，离心，收集沉淀；

A8、用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到固有淋巴样细胞；

所述壳聚糖包覆改性羰基铁的制备方法，包括以下步骤，

B1、按质量份数，取5～8份的纳米羰基铁粉末放入容器中，加入20～30份的无水乙醇，使用超声分散10～15分钟，加入10～15份的氨水，然后加热到35～40℃，在搅拌状态下逐滴加入3～5份的正硅酸乙酯，搅拌均匀后反应4～5小时，在氮气保护下进行抽滤、洗涤并烘干，得到改性羰基铁；

B2、取8～10份的壳聚糖颗粒溶于100～200份的去离子水中，搅拌均匀得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液以20～30kHz的功率超声后，加入40～50份的乙酸，在40℃恒温下搅拌1h，静置；

B3、向步骤B2处理后的壳聚糖溶液中加入30～40份的正己烷，在搅拌状态下滴入Span80进行预乳化，然后加入步骤B1中得到的改性羰基铁和1～2份的三乙烯四胺，40℃恒温下静置1～2h；

B4、静置后，以6000～8000r/min的速率搅拌10～20min，然后逐滴加入8～10份的环氧氯丙烷，40℃恒温下静置反应5h；

B5、用无水乙醇浸析，经离心分离、洗涤数次后，置于50℃真空箱中干燥，得到壳聚糖包覆改性羰基铁。

2.根据权利要求1所述的从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：所述步骤A1和A2中细胞解离液均为D-Hanks+10mM HEPES+5mM EDTA，所述D-Hanks、HEPES、EDTA的体积比为1:1:1。

3.根据权利要求2所述的从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：所述步骤A3中细胞消化液为D-Hanks+500μg/mL胶原酶D+500μg/mL DNase1+0.5U/mL分散酶+2％FBS溶液组成的混合溶液。

4.根据权利要求3所述的从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：所述步骤A3中D-Hanks、500μg/mL胶原酶D、500μg/mL DNase1、0.5U/mL分散酶和2％FBS溶液的体积比为1:1:1:1:1。

5.根据权利要求4所述的从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：所述步骤A6和A7中再次离心采用20℃、800×g离心10～20分钟。

6.根据权利要求5所述的从大龄小鼠结肠固有层中分离纯化固有淋巴样细胞的方法，其特征在于：所述稀释后抗体是指含990μl流式缓冲液与10μl抗体原液，稀释比为1:100。