[发明专利]柳杉激素胁迫下miRNA荧光定量内参基因及其引物的应用

说明书

本发明公开了柳杉激素胁迫下miRNA荧光定量内参基因及其引物的应用，属于植物分子生物学领域。本发明根据文献资料查阅和数据库搜索最终选择了本实施所需的13条候选内参基因，通过delta‑CT、GeNorm、NormFinder和BestKeeper四个软件对13个内参进行基因稳定性评价，以及RefFinder网址进行综合分析结果，获得了适用于柳杉GA₃胁迫下荧光定量内参基因cln‑miR6725、novel1和18S，以及ABA胁迫下荧光定量内参基因U6和novel16。为柳杉不同激素胁迫下miRNA的相关功能基因的表达定量提供了有力的支持，因而具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，更具体地说，涉及柳杉激素胁迫下miRNA荧光定量内参基因及其引物的应用。

背景技术

柳杉（Cryptomeria fortunei Hooibrenk ex Otto et Dietr），又名长叶孔雀松。乔木，其天然分布极其狭窄，主要分布在我国及日本等地。柳杉树形优美，材质优良，适应性强，生长快而持久，具有耐寒冷、干旱和瘠薄，抗风抗雪压能力等特性。脱落酸(ABA)是一种具有半萜结构的植物激素，在调节植物对逆境的适应中显得尤为重要。它能抑制种子萌发、促进休眠、抑制生长、促进叶片衰老脱落等。GA₃对柳杉的花芽分化有显著的促进作用，如日本柳杉施用GA₃可以显著提早结实年龄。然而现在关于柳杉在ABA胁迫和GA₃胁迫情况下基因表达的差异的研究报道甚少，在此过程中，涉及到运用实时荧光定量技术分析和验证基因的表达水平，就需要稳定可靠的内参基因，因此筛选柳杉不同激素胁迫条件下稳定表达的内参基因是实时荧光定量结果准确的关键因素。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的问题之一是获得柳杉在不同激素胁迫条件下表达稳定的miRNA荧光定量内参基因的应用，能够满足实时荧光定量检测柳杉其它基因转录表达水平的要求，提高柳杉基因表达分析研究的稳定性、可靠性和效率。本发明所要解决的另一问题是提供激素胁迫下miRNA荧光定量内参基因的引物的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明通过delta-CT、GeNorm、NormFinder和BestKeeper四个软件对13个内参进行基因稳定性评价，通过RefFinder网址综合分析结果，筛选出在不同激素胁迫条件下柳杉稳定表达的内参基因。

柳杉激素胁迫下miRNA荧光定量内参基因的应用，所述的激素胁迫是ABA胁迫或GA₃胁迫。

所述的ABA胁迫下柳杉miRNA荧光定量内参基因的应用中，所述的内参基因为U6和/或novel16基因，所述的novel16基因的核酸序列如SEQ ID NO .1所示。

所述的GA₃胁迫下柳杉miRNA荧光定量内参基因的应用中，所述的内参基因为cln-miR6725、novel1和18S基因，cln-miR6725基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示；novel1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示；18S基因的核苷酸序列如SEQ IDNO .4所示。

U6基因的引物序列在柳杉miRNA荧光定量中的应用，U6基因的引物序列如下：

U6正向引物：5′-ACAGAGAAGATTAGCATGGCC-3′；

U6反向引物：5′GACCAATTCTCGATTTGTGCG-3′。

novel16基因的引物序列在柳杉miRNA荧光定量中的应用，novel16基因的引物序列如下：

novel16正向引物：5′-GCGTTTTTCCAATACCTCCTATACC-3′；