[发明专利]一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，其特征在于，该重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株于2020年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V202082。

2.根据权利要求1所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，其特征在于，该重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株是通过新城疫病毒反向遗传操作技术和定点突变技术获得的。

3.根据权利要求2所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，其特征在于，所述新城疫病毒反向遗传操作技术是以新城疫病毒VII-NJ株为骨架实现的，所述新城疫病毒VII-NJ株于2019年7月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201945。

4.根据权利要求3所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株，其特征在于，所述定点突变技术是通过采用定点突变试剂盒将新城疫病毒VII-NJ株P基因开放阅读框的⁴⁰⁴CAT⁴⁰⁶突变为⁴⁰⁴TAG⁴⁰⁶，使W基因沉默表达，同时保证P基因和V基因正常表达。

5.如权利要求1至4中任意一项所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ的构建；

步骤二、新城疫病毒VII-NJ株NP、P、L辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L的构建；

步骤三、重组新城疫病毒VII-NJ株的拯救与鉴定；

步骤四、主质粒pCI-VII-NJ的定点突变；

步骤五、重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的拯救。

6.根据权利要求5所述的一种W蛋白沉默的重组新城疫病毒rVII-NJ-Wko株的制备方法，其特征在于，步骤一至步骤三具体包括以下步骤：

(1)新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ的构建

根据新城疫病毒VII-NJ株全基因组信息合成全基因组，在5’端引入单一限制性内切酶Sal I和锤头状核酶结构，在3’端引入单一限制性内切酶Not I和丁肝病毒核酶结构，将合成的全基因组序列插入至pCI-neo载体，鉴定正确后将其命名为新城疫病毒VII-NJ株全基因组主质粒pCI-VII-NJ；

(2)新城疫病毒VII-NJ株NP、P、L辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L的构建

根据新城疫病毒VII-NJ株全基因组信息，分别合成其NP、P、L基因，在各基因ORF前引入Kozak序列，在NP和P基因序列两端分别引入限制性内切酶Hind III和EcoR I，在L基因序列两端分别引入限制性内切酶Nhe I和Not I，将合成的NP、P、L基因序列分别插入至pcDNA3.1载体，鉴定正确后将其分别命名为辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L；

(3)重组新城疫病毒VII-NJ株的拯救与鉴定

取BHK-21细胞接种后待细胞生长至70～80％单层时，以磷酸钙转染试剂将主质粒pCI-VII-NJ与三个辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共转染BHK-21细胞，pCI-VII-NJ、pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L的质量比为4:2:1:1，每孔转染量分别为5μg、2.5μg、1.25μg和1.25μg，转染细胞于5％CO₂、37℃培养箱中培养12h后，弃去转染混合物，以含有10％DMSO的PBS休克细胞2.5min，加入完全DMEM培养液继续于5％CO₂、37℃培养箱中培养；4天后收获细胞上清，接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔，5天后收取鸡胚尿囊液，收获血凝和血凝抑制检测均为阳性的鸡胚尿囊液；将收集的鸡胚尿囊液感染生长过夜的DF1细胞，24h后，弃去培养液，以PBS洗涤细胞两次，室温下以预冷的80％丙酮固定30min，弃去丙酮，以PBS洗涤3遍后，配制含1％BSA的PBS缓冲液，按1:100倍体积比稀释鸡抗NDV高免血清作为一抗室温下与细胞共孵育30min，弃掉抗体稀释液，以PBST洗涤3遍，加入以1％BSA按1:300体积比倍稀释山羊抗鸡FITC标记荧光抗体，同时加入以1:500体积比倍稀释的伊文思蓝染色液对细胞背景进行染色，室温避光条件下孵育30min，最后以PBST洗涤细胞三次后于荧光显微镜下观察，鸡抗NDV高免血清检测鸡胚尿囊液感染细胞显示阳性绿色荧光信号，未感染病毒细胞只显示红色背景颜色；电子显微镜观察呈现典型新城疫病毒颗粒形态特征，表明利用NDVVII-NJ株基因组成功救获具有感染性的重组病毒，将其命名为rVII-NJ。