[发明专利]一种生物菌肥发酵过程中阿魏酸含量的快速检测方法

权利要求书

1.一种生物菌肥发酵过程中阿魏酸含量的快速检测方法，其特征在于:包括以下步骤：

步骤一：准备试验材料

不同发酵时期的微生物菌株发酵产物，反式阿魏酸标准品，95％乙醇，冰醋酸，甲醇，氯仿，紫外分光光度计，万分之一电子天平；

步骤二：试验方法

预试验，具体包括以下步骤：

A.阿魏酸标准液的配制

(1)精确称取阿魏酸标准品20mg于2ml离心管中，先用50μl的95％乙醇溶解，再加入1.95ml的无菌水，取10μl该溶液，用无菌水稀释至1ml，即可得到浓度为0.1mg/ml的阿魏酸标准液①；

(2)精确称取阿魏酸标准品20mg于2ml离心管中，用2ml的95％乙醇溶解，取10μl该溶液，用无菌水稀释至1ml，即可得到浓度为0.1mg/ml的阿魏酸标准液②；

B.阿魏酸标准曲线的绘制

(1)用无菌水将0.1mg/ml的阿魏酸标准液①配制成0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml这7个浓度梯度；以无菌水为参比，在330nm波长处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程，得到标准曲线1；

(2)用95％乙醇将0.1mg/ml的阿魏酸标准液②配制成0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml这7个浓度梯度；以无菌水为参比，在330nm波长处测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程，得到标准曲线2；

步骤三：样品处理

A.微生物菌株浸提液的制备

称取微生物菌株发酵产物100g，按质量体积比1：2：0.2加入无菌水和95％乙醇，加盖静置2h，双层纱布过滤，制得浸提液；

B.层析液的选择及配制

在多种层析液配比中，选择体积比为氯仿：甲醇：水：冰醋酸为2：2：6：0.5的层析液进行层析，阿魏酸可以与其他物质完全分离，斑点集中，无拖尾现象；用移液枪吸取上述溶液，将溶液依次加入到试剂瓶中，振荡摇匀，期间敞开瓶盖放气，然后静置，直至完全分层；

C.浸提液中阿魏酸含量的测定

(1)用无菌水分别将浸提液稀释5、10、20、40、100、200、400、1000倍，以无菌水为参比，在330nm波长处测定吸光度，以稀释倍数的倒数为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程，得到吸收曲线1；

(2)用微量进样器分别吸取各稀释倍数的浸提液10μl，长条状均匀点样于层析滤纸上，冷风吹干，以步骤三中B步骤中的层析液展开；在紫外灯定位后剪下含有标准液的层析滤纸，装入20ml的具塞试管中，加入10ml95％乙醇，振荡15min，吸取上清液；以无菌水为参比，在330nm波长处测定吸光度，以稀释倍数的倒数为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程，得到吸收曲线2。

2.根据权利要求1所述的一种生物菌肥发酵过程中阿魏酸含量的快速检测方法，其特征在于：所述紫外分光光度计的型号为UV-1780。

3.根据权利要求1所述的一种生物菌肥发酵过程中阿魏酸含量的快速检测方法，其特征在于：具体操作方法为：选取发酵过程中的发酵物100g，用10ml的95％乙醇和190ml的水加盖浸提2h，将浸提液稀释40倍后，在330nm波长下；以无菌水为参比测定吸光度，测得的吸光度代入标准曲线1的回归方程中，得出的浓度先乘以稀释倍数40，再乘以纯度系数81.36％，即可得到该阶段发酵物中阿魏酸的含量。