[发明专利]用于2019-nCoV和SARS病毒PCR检测的内参基因、试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供一种用于2019‑nCoV和SARS病毒PCR检测的内参基因、试剂盒及检测方法。本发明的内参基因通过在小鼠肌肉RAB3A癌基因片段两端连接2019‑nCoV病毒和SARS病毒同源基因片段得到。本发明试剂盒以上述内参基因或包含上述内参基因的重组质粒作为内部质控，该内参基因为同源性内参基因，在PCR检测过程中可降低对结果的抑制，减少假阴性结果，提高检测准确性。采用本发明的试剂盒可同时检测2019‑nCoV和SARS病毒，检测结果准确可靠，灵敏度高，并同时可检测扩正体系是否正常。

技术领域

本发明涉及生物技术和分子诊断领域，特别是涉及一种用于2019-nCoV和SARS病毒 PCR检测的内参基因、试剂盒及检测方法。

背景技术

冠状病毒是自然界广泛存在的一类病毒，因该病毒形态在电镜下观察类似王冠而得名。 目前发现，冠状病毒仅感染脊椎动物，可引起人和动物呼吸道、消化道和神经系统疾病。人 感染了冠状病毒后常见体征包括：呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重 病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。

新型冠状病毒(2019-nCoV)是新发现的冠状病毒新毒株。新型冠状病毒所致疾病目前 暂无特异治疗方法。病理解剖中发现，感染后首先累及到肺，表现为肺脏里面有实变，有大 量的渗出，有炎症细胞因子的侵润，以及炎症细胞大量的浸润等。同时，在小的支气管里可 以看到较多分泌物，堵塞小气道，影响气体交换。电镜下肺部可见病毒颗粒。免疫系统受累 比较严重，临床上表现为白细胞少，淋巴细胞减少，病人免疫力下降，容易出现细菌和真菌 感染。

冠状病毒(Coronaviruses，CoV)属于尼多病毒目冠状病毒科，为有包膜的单股、正链 RNA病毒，分为α、β和γ三个属。冠状病毒的特征是具有从其表面突出的棍棒状突刺。冠状病毒一般包括纤突蛋白(spike，S)、小包膜蛋白(envelope，E)、囊膜蛋白(membrance，M)、核蛋白(nucleocapsid，N)。SARS-CoV-2为β冠状病毒属类SARS冠状病毒种，基因序列分别为5'非翻译区(UTR)、复制酶复合体(orf1ab)、S基因、E基因、M基因、N基因、3'UTR 和一些不确定的非结构性开放阅读框，包含4个主要结构蛋白，分别为刺突糖蛋白(S蛋白)、 膜蛋白(M蛋白)、膜蛋白(E蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)，所有这些蛋白均在病毒基因 组的3'端编码。S蛋白可识别宿主细胞受体并介导膜融合，S蛋白与宿主细胞的病毒受体结 合。E蛋白具有N端胞外域和C端内域，且具有离子通道活性，有助于病毒的组装和释放， 缺乏E蛋白的重组病毒会造成病毒致命性减弱。M蛋白是病毒体中最丰富的结构蛋白，有3 个跨膜结构域，可以使病毒体形成其形状。M蛋白具有一个小的N端糖基化胞外域和一个大 的C端内域，在病毒颗粒内延伸6～8nm。M蛋白在病毒体中以二聚体形式存在，并且可能采 用两种不同的构象，从而使其既能够促进膜弯曲又能与核衣壳结合。M蛋白保持病毒形态， 并连接N蛋白，E蛋白和M蛋白，主要参与病毒的装配过程。N蛋白也与复制酶复合物的关 键成分nsp3和M蛋白结合，这些蛋白质相互作用可能有助于将衣壳化的基因组包装成病毒 颗粒。由于RNA病毒复制酶缺少校正功能，病毒复制过程中易发生突变。

目前，市面上还没有既可以检测新型冠状病毒又可以检测非典型肺炎病毒的双检试剂。 而现有的检测新型冠状病毒的试剂大多是检测ORF Iab和N基因，而内部参考品为非同源性 内参，可能会出现对结果的抑制，导致假阴性报告。国家生物信息中心披露的2019-nCoV信 息库ORF1ab基因的11083位点，随着疫情发展，其群体发生频率从0逐步增加到22％，随 后递减至8％，具有较大的不稳定性，可以预见，后期ORF1ab基因可能还会发生更高突变， 故其检测可靠性差。

因此，有必要开发一种采用同源性内参和包含该同源性内参的双检试剂，减少PCR抑制， 减少假阴性结果。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种用于2019-nCoV和SARS病毒PCR检测的内参 基因，该内参基因为同源性内参基因，在PCR检测过程中可减少PCR抑制，减少假阴性结果。