[发明专利]一特异识别猪IGF2R位点的sgRNA及其编码DNA和应用

说明书

本发明公开了一特异识别猪IGF2R位点的sgRNA及其编码DNA和应用。所述的特异识别猪IGF2R基因的sgRNA识别猪IGF2R基因的36内含子，具有SEQ ID NO1‑2所示。本发明设计了两条特异识别猪IGF2R基因的sgRNA，借助CRISPR/Cas9基因编辑系统与荧光富集的方法，高效的实现猪IGF2R基因的大片段敲除，经克隆检测，纯合子效率可达29%，可用于后续针对猪IGF2R基因功能研究。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及二条特异识别猪IGF2R位点的sgRNA及其编码DNA和应用。

背景技术

胰岛素样生长因子是一类参与调节碳水化合物、脂类、蛋白质代谢，促进细胞增殖和分化的小分子多肽类生长因子，影响组织发育。其受体IGF2R属于多结构域跨膜蛋白，可以介导溶酶体的分选和转运过程。IGF2R可与IGF2、TGF-β前体等M6P配体相互作用，的水平，调节动物的生长发育。但其调控动物生长和分化的相关分子机制尚未完全解析。

我国是世界最大的猪肉生产国和消费国，但是目前市场仍以生长速度快、饲料报酬高的西方三元猪（杜洛克、长白和大白）为主，我国地方品种猪具有繁殖力高、抗逆性强等鲜明的特色，因此地方品种资源亟待开发。通过三代Pacbio长度长测序技术，我们在藏猪内含子区域存在274bp的缺失（274bp-deletion），同时藏猪肌肉、脂肪、下丘脑等组织的IGF2R表达量低于其他品种猪。

以藏猪内含子区域存在274bp-deletion为研究对象，利用基因组编辑技术制备IGF2R基因编辑猪细胞模型，揭示274bp-deletion对IGF2R基因表达的调控规律，将为后续研究274bp-deletion及IGF2R基因对猪生长速度、抗逆表型提供素材和基础。

ZFN（锌指核酸酶）和TALEN（转录激活因子样效应物核酸酶） 基因编辑技术是目前研究较为成熟的两种种定点突变技术，但是这两种技术构建程序较为繁琐，每一个位点需要构建一对相应的核酸酶，而 CRISPR/Cas9（规律成簇间隔短回文重复序列/ 规律成簇间隔短回文重复序列关联蛋白） 系统对特异位点的识别靠小的 crRNA 的引导，CRISPR 区可以有一系列的 crRNA 组成，每个针对特异位点的 crRNA只有几十个碱基，整个载体较小，相对于 ZFN 和TALEN 载体，更加容易构建。

因此，寻求能高效的特异性识别猪的IGF2R基因的序列，并借助Cas9酶对该位点进行高效的定点切割，将会为后面的针对猪IGF2R基因274bp-deletion功能研究实验打下了坚实的基础。

本发明之前研究发现该基因在藏猪12内含子区域存在大片段缺失，针对这一特异性缺失我们设计了两条特异识别猪IGF2R基因的sgRNA，借助CRISPR/Cas9基因编辑系统与荧光富集的方法，高效的实现猪IGF2R基因的大片段敲除，经克隆检测，纯合子效率可达29%。其为后面的针对猪IGF2R基因功能研究实验打下了坚实的基础。

发明内容

本发明公开了一特异识别猪IGF2R基因的sgRNA，其特征在于具有如下特征：

pIGF2R-sg98：CTGCAGACCTAGTGACGCAG SEQ ID NO.1

pIGF2R-sg241：CACATAACCTTGTGCGTTCA SEQ ID NO.2

本发明所述特异识别猪IGF2R基因sgRNA编码的核苷酸序列，其特征在于，所述pIGF2R-sg98和pIGF2R-sg241识别的靶片段，为SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列。

本发明进一步公开了编码sgRNA的DNA分子、含有所述DNA分子的表达盒或表达载体。

本发明也公开了一用于特异识别猪IGF2R基因sgRNA的特异性引物，具有如下特征：