[发明专利]抑制疟原虫感染的单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及动物细胞技术领域，具体公开了抑制疟原虫感染的单克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤：阳性克隆的获取、原核表达、纯化重组蛋白、重组蛋白免疫小鼠、融合细胞制备、收集免疫后小鼠脾细胞、融合培养、单克隆筛选和杂交瘤细胞培养。本发明获得的单克隆抗体PfRH5‑1和PfRH5‑2能够明显抑制疟原虫入侵红细胞，降低疟原虫的感染率。

技术领域

本发明涉及动物细胞技术领域，具体涉及抑制疟原虫感染的单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

疟疾是通过雌性按蚊叮咬吸血传播的重要寄生虫病。WHO《2020年世界疟疾报告》指出：2019年在91个国家有2.29亿疟疾感染病例，全球疟疾死亡总数达40.9万人，数据表明近四年来全球的疟疾患者数量没有减缓的趋势。疟原虫是疟疾的病原体，感染人的疟原虫有5种：包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫，恶性疟原虫是非洲地区最流行的疟原虫，占2019年疟疾病例的99.7％。疟原虫生活史包括在人体内的发育和在雌性按蚊体内的发育两个部分。在人体内的发育有包括红外期和红内期两个时期。通过携带有疟原虫的雌性按蚊叮咬感染人体，疟原虫子孢子进入人体，在肝脏内发育增殖后释放入血，一部分被吞噬细胞吞噬，一部分侵入红细胞内裂体增殖，导致红细胞大量破坏后引起发热、贫血、脾肿大及肾脏损害等。在恶性疟疾高度流行地区，5岁以下儿童、孕妇、AIDS患者以及无疟疾免疫力人群易引发凶险型疟疾，若未及时治疗或处理不当，易造成患者死亡。虽经多年防治，疟疾仍然是一种世界范围内高发病率和高死亡率的严重公共卫生问题，其与结核病、艾滋病并称世界三大传染病。

抗疟药、蚊媒控制和疟疾疫苗是防治疟疾的重要手段，然而，全球范围内已经出现了耐药性疟原虫株和按蚊，致使疟疾防控受到严峻挑战。疟原虫裂殖子入侵红细胞是疟疾致病的关键机制，该过程是由裂殖子配体与宿主受体间的相互作用来介导的。疟原虫裂殖子是利用多个配体,如：红细胞结合蛋白(Erythrocyte Binding Like proteins，EBL)家族和网状红细胞结合蛋白(Reticulocyte binding like proteins，RBL)家族来入侵红细胞。PfRH5是恶性疟原虫RBL家族的新成员，位于裂殖子顶端的棒状体内，是近期研究发现的参与裂殖子入侵的重要蛋白。这一发现的重要意义更在于，很多种株的恶性疟原虫都存在PfRH5与其配体的结合，而此前所发现的能介导疟原虫入侵红细胞的途径都只对少数种株恶性疟原虫有效；还有研究显示，基于PfRH5的疫苗在灵长类动物夜猴能够产生针对不同种属疟原虫的抵抗力。所以PfRH5被誉为开启恶性疟原虫这一“阿喀琉斯之踵”的万能钥匙。

目前尚未有应用恶性疟原虫RH5的单克隆抗体抑制疟原虫裂殖子入侵。多克隆抗体由于抗体成分复杂，并不适合用于临床治疗的原因，所以开发有效的单克隆抗体是非常有必要的。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了抑制疟原虫感染的单克隆抗体及其制备方法和应用，制备得到的两株单克隆抗体均可以检测恶性疟原虫或者筛选相应的药物。

本发明第一个目的是提供了抑制疟原虫感染的单克隆抗体的其制备方法，具体包括如下步骤：

S1，阳性克隆的获取：选用PfRH5蛋白序列的201-324aa段氨基酸序列相应的编码基因合成克隆入原核表达载体PGEX4T-1，选择阳性克隆标记为PfRH5-1，选用PfRH5蛋白序列的302-396aa段氨基酸序列相应的编码基因合成克隆入原核表达载体PGEX4T-1，选择阳性克隆标记为PfRH5-2；

S2，原核表达：

将两个阳性克隆菌种分别接种于含抗生素的LB培养基中培养，加入诱导物IPTG继续培养过夜，破碎大肠杆菌，将破碎的菌液离心，分别收集上清和沉淀；

S3，纯化重组蛋白：

收集的上清用0.22μm滤膜过滤后过柱，收集目的蛋白PfRH5-1-GST和PfRH5-2-GST，洗脱后透析，然后浓缩至1mg/mL，即为抗原；