[发明专利]非洲猪瘟病毒的引物组合、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒的引物组合、试剂盒及其应用，引物组合包括：上游引物ASFV‑MF：5’‑TCAGTATCCATTCCCTTCG‑3’；下游引物ASFV‑MR：5’‑TTGTGCCAATCTCGGTGT‑3’，并以此提供了一种方便诊断的试剂盒，建立相应的检测方法。与现有技术相比，本发明的引物序列灵敏度高，条带明亮，最低检测限度为1.40×10³copise/μL；进一步地，本发明建立了一个快速精准检测ASFV病毒的试剂盒，具有灵敏性高、特异性强、成本低的特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及非洲猪瘟病毒的基因检测，尤其是涉及一种非洲猪瘟病毒的引物组合、试剂盒及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起猪的一种急性、发热、高度接触传染性疾病。家猪与野猪普遍易感，软蜱为ASFV的贮藏宿主和媒介。该病于1921年首先在肯尼亚爆发，此后很长一段时间ASF仅在非洲南部的大多数国家流行，1957年，ASFV第一次传播到非洲以外的国家：葡萄牙，原因是飞机上的废弃物饲喂了里斯本机场附近的家猪。随后ASF在欧洲的其他国家爆发。2018年8月初，扈荣良研究员率先报道我国第一例非洲猪瘟疫情，短短一年之内，该病蔓延至全国30个省市自治区，已造成全国20％以上减产率，损失超过百亿元，目前该病防控形势异常严峻复杂。ASFV的潜伏期为5-15天，一旦爆发病程短，病死率高，可达100％。临场症状复杂且难以与其他疾病进行区分，多表现为高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。然而，非洲猪瘟发病后并没有有效的治疗措施，且该病毒具有复杂的免疫逃避机制，缺乏典型的中和抗体，也没有有效的疫苗防疫，因此建立一种快速、灵敏、准确的检测方法显得尤为重要。

ASFV是一种直径约为170-200nm的正20面体病毒，由内部的双链DNA和外周的衣壳及囊膜组成，大小约170～190kb。ASFV基因组的两端通过部分碱基配对形成发夹环，中间区域较为保守，两端靠近发夹环部位有末端重复序列和可变区，ASFV基因组大小变化由可变区决定。ASFV的整个基因组含有151个开放阅读框(ORFs)，可以编码150-200种蛋白质，大致可分成5大种类，包括分泌性蛋白、假定膜蛋白、参与核甘酸和核酸代谢(DNA修复)的酶以及蛋白修饰的酶。P72蛋白是病毒的主要衣壳蛋白，位于ASFV的较保守的编码区，同时经过近半个世纪的遗传进化，仍保持较高的同源性，然而P72存在部分变异频率较高的区域，因此P72也被用于ASFV的基因分型。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种非洲猪瘟病毒的引物组合、试剂盒及其应用。本发明的引物序列灵敏度高，条带明亮，最低检测限度为1.40×10³copise/μL。进一步地，本发明建立了一个快速精准检测ASFV病毒的试剂盒，具有灵敏性高、特异性强、成本低的特点。

本发明通过分析ASFV的遗传进化树，选取与国内流行的ASFV毒株同源性最高的几个分支以及近几年各国流行的ASFV典型毒株的P72基因序列进行比对，根据比对结果，以国内流行的ASFV毒株的P72中段的同源性较高的序列作为模板设计引物，目的片段为428bp，且设计的引物避开变异区，能够最大限度识别目前流行的所有ASFV毒株，并研制方便诊断的试剂盒，建立相应的检测方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面提供一种非洲猪瘟病毒的引物组合，包括：

上游引物ASFV-MF：5’-TCAGTATCCATTCCCTTCG-3’(SEQ ID NO:1)；

下游引物ASFV-MR：5’-TTGTGCCAATCTCGGTGT-3’(SEQ ID NO:2)。

本发明第二方面提供一种非洲猪瘟病毒的试剂盒，含有所述的引物组合，记为PCRMix。