[发明专利]一种检测酪氨酸酶活性的方法

说明书

本发明公开了一种不需要标记、不需要复杂合成、利用常见化合物的组合来检测酪氨酸酶活性的荧光方法。将葫芦[8]脲(CB[8])、硫黄素T(ThT)和多肽YLA或Dopa‑LA三者按比例简单混合，即可用于检测酪氨酸酶的活性。具体而言，在CB[8]‑ThT‑YLA/Dopa‑LA溶液中加入不同浓度的酪氨酸酶溶液，在激发波长为417 nm、发射波长为570 nm下进行荧光测量，得到荧光信号随时间变化的曲线，进一步推算出酶反应速率与酶浓度关系，经简单线性拟合即可定量检测酪氨酸酶浓度。本发明的方法不需要合成复杂的荧光分子或材料，且可以对酪氨酸酶的活性进行连续监测，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种酪氨酸酶活性的荧光检测方法。

背景技术

酪氨酸酶是一种含铜金属氧化还原酶，在微生物、动物、植物和人体中都有分布，其在黑色素的代谢过程中起到很重要的作用。酪氨酸酶可以催化酪氨酸转变为多巴，然后氧化多巴形成多巴醌，多巴醌在生物体内经过一系列反应后，可以形成黑色素。酪氨酸酶活性过高或缺失，都会影响黑色素的产生，进而可能引起雀斑、褐斑、皮肤癌、白癜风、白化病、黑色素瘤等疾病。因此，开发酪氨酸酶活性检测方法具有重要意义。

由于酪氨酸酶的底物是酪氨酸、多巴等含酚羟基的分子，目前使用的荧光探针多数是酚类衍生物或者含酚类衍生物的材料，大部分需要进行相对复杂的化学合成。本发明中使用的大环分子葫芦[8]脲(CB[8])、荧光分子硫黄素-T (ThT)和多肽YLA或Dopa-LA均是可以购买得到的，不需要经过复杂的合成。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用荧光来检测酪氨酸酶活性的方法。该方法不需要标记、不需要合成复杂的荧光分子或材料，且可以对酪氨酸酶的活性进行连续监测，应用前景广阔。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1.CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA体系

将多肽YLA或Dopa-LA与ThT、CB[8]以不同摩尔比在缓冲液中均匀混合，孵育适当时间后，在激发波长417 nm、发射波长450 nm - 699 nm下进行光谱扫描，同时测定激发波长为417 nm、发射波长为570 nm的荧光信号值。

2.酪氨酸酶活性的检测

将CB[8]、ThT和YLA/Dopa-LA以特定摩尔比在缓冲液中均匀混合后恒温孵育一定时间，把不同浓度酪氨酸酶溶液加入上述体系，在激发波长417 nm、发射波长570 nm下进行持续荧光测量，每隔1 min测一次。根据荧光信号随时间变化的曲线，可以算出酶催化反应的速率，经线性拟合发现速率与酶浓度成正比，表明该方法可用于测定酪氨酸酶活性。

3.曲酸抑制酪氨酸酶活性的检测

将酪氨酸酶与不同浓度的抑制剂分子恒温孵育一定时间后，加入特定摩尔比的CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA溶液；在激发波长为417 nm、发射波长为570 nm下进行荧光信号强度测定，同样每隔1 min测一次。根据荧光信号随时间变化的曲线，可以算出酶催化反应的速率与抑制剂浓度的关系，进一步的可以计算出抑制剂的IC50值。

本发明的检测原理：ThT分子可以与CB[8]结合，且结合后荧光信号会增强；多肽YLA或Dopa-LA也可以结合CB[8]，那么在CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA的三元体系中，若多肽浓度较高，则ThT与CB[8]结合较少，其荧光信号增强的幅度会降低；在酪氨酸酶的作用下多肽YLA/Dopa-LA会被氧化成复杂产物，这些产物与CB[8]结合力很弱，因此ThT与CB[8]的结合会变多，荧光信号会增强。据此，我们根据CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA这个三元体系在加入酪氨酸酶后荧光信号增强的快慢，即可测定酪氨酸酶的活性。

本发明的有益效果在于：本发明建立的基于CB[8]-荧光分子-多肽的三元体系，能快速、准确地实现对酪氨酸酶活性进行连续监测；整个操作过程非常简单，无需任何修饰和标记，成本低廉，具有较强的应用性。