[发明专利]一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法

说明书

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法，包括以下步骤：A、ARTP诱变菌株保藏，B、验证并确定低耗糖菌株，C、选育验证，D、遗传性检测；利用此方案得到的新菌株对碳源的利用量更低，可以直接降低生产成本，带来直接的经济效益；且获得的菌株在发酵中剩余的残糖量更低，可以一定程度上缓解三废处理的压力，本方法获得的菌种具有遗传稳定性，可供给大规模生产使用。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法。

背景技术

硫酸粘杆菌素(Colistin Sulfate)又名粘杆菌素、抗敌素、多粘菌素E，是从多粘芽胞杆菌变种(Bacillus polymyxa var.colistimus)的培养液中提取的一种碱性多肽类抗生素。近十几年来，由于药物残留和耐药问题对人类产生的潜在危害日益突出，发达国家相继禁用了若干种饲用抗生素。硫酸粘杆菌素因内服胃肠道不易吸收，不易产生耐药性，对革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、绿脓杆菌等有强大的抗菌作用而引起畜牧兽医工作者的关注。美国和欧盟将其批准作为兽药使用，在日本还被用作饲料添加剂。我国在20世纪90年代末由山东鲁抗医药集团成功研制了硫酸粘杆菌素及其制剂，并于2002年被农业部批准为国家三类新兽药。

尽管基因工程技术已经开始用于工业生产高产菌株的构建，但是物理、化学诱变因子如紫外线、高频电子流、亚硝基胍等仍然是遗传育种不可或缺的手段。为了提高诱变后高产菌株的筛选效率，人们设计了各种筛选方案，如川氏设计了琼脂块法，Elander RP.等人提出利用前体及结构类似物抗性的筛选方法，它们在菌种选育中取得了较好的效果。周希贵、戴鹏高等公开了一种“粘杆菌素高产菌株的选育”方法(中国知网)，用亚硝基胍对多粘类芽胞杆菌(Paenibacilluspolymyxa)AS1 5 4 1进行诱变，采用其自身次生代谢产物粘杆菌素进行筛选时正突变率为32.3％。目前进行的相关研究多是围绕提高效价为目的，但是随着环境管理的升级，危废的安全治理，生产成本的增加，成为企业生存的命脉，成本的节降成为目前大多数企业解决的头等大事。

发明内容

本发明为了解决上述现有技术中存在的问题，针对影响粘菌素生产成本最大的关键因素-碳源的用量，进行了根本性的解决，提供了一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法，提不仅提高了效价，降低了碳源的使用量，而且残糖的降低，直接减少了对尾废治理的压力。

本发明采用的具体技术方案是：一种选育多粘菌素E低耗糖菌株的方法，关键是，包括以下步骤：

A、ARTP诱变菌株保藏

1)、将生产使用的多粘菌素E菌种接种活化瓶进行培养

所用活化培养基成分为(g/L)：酵母粉30.0g，麦芽提取物30.0g，氯化钠5g，培养基pH7.0-7.2；

培养条件：摇床振幅5cm，转速为200-220rpm，培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期16h；

2)、在1)中吸取10mL进行5分钟/3000rpm离心，倒出上清液，加入10％甘油溶液混匀再次离心，倒出上清液后，加入5mL10％甘油溶液，摇匀成孢子悬液，使孢子浓度达到10⁷-10⁸；进行ARTP诱变，得到诱变菌株，

所用10％甘油溶液的配制方法(mL/L)：量取100mL甘油，纯化水定容到1000mL摇匀；

3)、将2)中的诱变菌株稀释分离到平板培养基上进行培养，

平板培养基成分为(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨15.0，酵母粉2.0，氯化钠3.0，琼脂20.0，培养基pH7.0-7.2；培养温度30.0℃-32.0℃，培养周期48h；

4)、在3)中挑选单菌落，大小适中，颜色阴白，接种到活化瓶培养基中，活化培养基及培养条件同1)，得到成熟的活化液种子；