[发明专利]一种诱导多能干细胞定向分化制备胰岛β细胞的培养液

说明书

本发明的一种诱导多能干细胞定向分化制备胰岛β细胞的培养液，培养液包括AdvancedDMEM/F12培养基、葡萄糖、碳酸氢钠、人血清白蛋白(HSA)、N2、B27、谷氨酰胺、维生素C、JNK抑制剂、hedgehog通路拮抗剂、EGF信号因子、FGF信号因子、TGF‑β抑制剂、WNT信号通路激活剂、Notch信号通路抑制剂、小分子化合物和微量元素，所述培养液在细胞培养的不同阶段的配比不同，各组分分阶段定向发挥作用，可以高效地诱导多能干细胞定向分化为胰岛β细胞。

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，具体来说是一种诱导多能干细胞定向分化制备胰岛β细胞的培养液。

背景技术

糖尿病(DiabetesMellitus，DM)是一种以血糖增高为临床特征的代谢障碍性疾病，其主要发病机制为胰岛素的分泌减少及其利用障碍。目前，糖尿病已成为继肿瘤、心脑血管后的第三大威胁人类健康和影响人们生活质量的疾病。世界卫生组织(WHO)在2016年的最新报告显示，全球已有4.22亿人患有糖尿病，而中国糖尿病患者数量超过1亿人，居全球之首。

糖尿病有两种类型：一型糖尿病(T1D)，占疾病数量的5～10％，是一种胰岛β细胞被选择性破坏而导致的自身免疫疾病；二型糖尿病(T2D)，占疾病数量的90％以上，是由于外周器官包括肝脏、脂肪和肌肉对胰岛素抵抗而产生的疾病。糖尿病人表现为体内胰岛素产生细胞--胰岛β细胞的缺失或胰岛素的利用降低，目前治疗手段皆为外源注射胰岛素以控制体内血糖平衡。虽然这种方法可以有效地控制疾病发展，但长期注射胰岛素不能稳定的维持体内血糖生理平衡而导致一些高风险疾病和并发症的发生。如低血糖和高血糖等并发症引起的血管病变会引起一些心血管、肾脏或神经疾病。因此，需要一种可以减少甚至消除长期并发症的治疗策略用于糖尿病的治疗。

一种可行的方法为将人类胰岛移植入病人体内进行糖尿病的治疗。这种方法可以很好地控制人体内血糖平衡，免除长期胰岛素注射的依赖和痛苦，并进而提高整体生活质量。然而，受限于供体胰岛的缺乏、供体-受体间胰岛的免疫排斥以及胰岛准备等方面的可变性，使得胰岛移植治疗糖尿病的方案不能普遍适用。因此，目前研究集中在可以获得大量产生胰岛素分泌细胞的替代方案。

其中一种方法为使用胚胎干细胞(hESCs)直接分化为胰岛素分泌细胞。但由于受到伦理道德的限制，目前可应用的胚胎干细胞系有限，更不适于应用到未来的临床细胞治疗中。后来的研究主要集中在使用其它类型的多能干细胞分化为胰腺内分泌细胞，表现为联合使用信号分子及其相关抑制剂/激动剂来实现的，一般按照6-7个连续分化阶段进行分化，分别是：定型内胚层(DE)、原始胚肠管(PrimitiveGutTube)、后前肠(PosteriorForegut)、胰腺内胚层(PE)、内分泌前体细胞(EP)和β样早期细胞，并进一步分化为成熟胰岛β样细胞。但这样的分化方法产生的仍为不成熟的β细胞，其表达的激素有限且不稳定、类型多样而胰岛素含量有限，不能用于移植治疗糖尿病患者。

综上，由于胰岛素注射会导致多种并发症，胰岛移植来源受限以及原有的胰岛β细胞分化方案不成熟、数量少或不具有GSIS功能等限制，使得糖尿病治疗受到很大的限制，新的胰岛β细胞分化方法和新的糖尿病治疗策略急需解决。

发明内容

1.发明要解决的技术问题

本发明的目的在于解决现有的胰岛β细胞分化产生的胰岛β细胞数量少且功能不完善的问题。

2.技术方案

为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明的一种诱导多能干细胞定向分化制备胰岛β细胞的培养液，培养液包括AdvancedDMEM/F12培养基、葡萄糖、碳酸氢钠、人血清白蛋白(HSA)、N2、B27、谷氨酰胺、维生素C、JNK抑制剂、hedgehog通路拮抗剂、EGF信号因子、FGF信号因子、TGF-β抑制剂、WNT信号通路激活剂、Notch信号通路抑制剂、小分子化合物和微量元素，所述培养液在细胞培养的不同阶段的配比不同。