[发明专利]一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法

权利要求书

1.一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：将诱导多能干细胞放置于第一阶段培养液进行分化得到初级角质细胞，将初级角质细胞放置于第二阶段培养液进行分化得到成熟角质细胞，所述第一阶段培养液包括：DMEM/F12基础培养液、KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇、SU6656、Retinoic acid、CHIR99021、hEGF和NKH477；第二阶段培养液包括：DMEM/F12基础培养液、KOSR、非必须氨基酸NEAA、L-Glutamine、β-巯基乙醇、BMP4和抗坏血酸。

2.根据权利要求1所述的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S100、接种诱导多能干细胞，将诱导多能干细胞接种于培养板上；

S200、第一阶段培养，将诱导多能干细胞放置于第一阶段培养液中进行分化得到初级角质细胞；

S300、第二阶段培养，将初级角质细胞放置于第二阶段培养液进行分化得到成熟角质细胞。

3.根据权利要求2所述的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤S100具体为将贴壁培养的诱导多能干细胞消化为单细胞，单细胞计数后，按照3～6万细胞/cm²密度接种于提前一小时经基质胶Matrigel包被的培养板上。

4.根据权利要求2所述的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：所述诱导多能干细胞由健康人外周血单核细胞重编程获得，所述诱导多能干细胞为8～25代细胞，所述培养板使用基质胶Matrigel的浓度为8-12mg/mL。

5.根据权利要求4所述的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：所述培养板使用基质胶Matrigel包被具体为使用DMEM培养基稀释Matrigel，按照1～3mg/cm²的浓度于37℃条件包被1小时，使用前弃掉孵育板子的配液。

6.根据权利要求2所述的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤S200具体为将接种有诱导多能干细胞的培养板放置于第一阶段培养液中，并置于温度为35～39℃、CO₂含量3～7％的条件下进行培养6或7天，每隔1天更换一次培养液，并在培养的前24小时内加入ROCK抑制剂。

7.根据权利要求2所述的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤S300具体为当步骤S200中的初级角质细胞培养至聚合度为50％时，将培养液换成第二阶段培养液，并置于温度为35～39℃、CO₂含量3～7％的条件下进行培养6天，每天更换一次培养液。

8.根据权利要求2所述的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：所述第一阶段培养液和第二阶段培养液中DMEM/F12基础培养液的体积比为1:0.9～1.3，所述第一阶段培养液和第二阶段培养液中KOSR的浓度为15％-30％，所述第一阶段培养液和第二阶段培养液中的非必须氨基酸NEAA的浓度为1％，所述第一阶段培养液和第二阶段培养液中L-Glutamine的浓度为0.5-1mM，所述第一阶段培养液和第二阶段培养液中β-巯基乙醇的浓度为0.05-1.20mM。

9.根据权利要求2所述的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：所述第一阶段培养液中SU6656的浓度为3-10μM、视黄酸Retinoic acid(RA)浓度为0.5-2μM、CHIR99021浓度为5-20mM、hEGF浓度为8-16ng/mL、NKH477浓度为0.05-0.2mM。

10.根据权利要求2所述的一种基于多能干细胞分化制备角质细胞的培养方法，其特征在于：所述第二阶段培养液中BMP4浓度为0.05-0.8nM、抗坏血酸浓度为0.05-2μM。