[发明专利]一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法及其应用

权利要求书

1.一种快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）、将目的基因构建到毕赤酵母载体pGAPZα系列载体中，构建质粒；

（2）、进行聚合酶链式反应：

采用引物GAP-mF：5' CCTAGGAAATTTTACTCTGCTGGAG 3'

GAP-mR：5' GACGGTAACGGGCGGTGGAAGGAGAG 3'

进行易错聚合酶链式反应，以Taq酶作为聚合酶，在反应体系中先加入等量0.2-0.3mM的4种dNTP，为dATP、dCTP、dGTP、dTTP，再补加0-0.6mM的任意一种dNTP以及0-0.5mM的氯化锰，以步骤（1）构建的质粒为模板进行易错聚合酶链式反应，方法是：95℃预变性5分钟、95℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃延伸5-10分钟，循环30次，72℃反应10分钟，得PCR产物；

（3）、用PCR产物回收试剂盒回收步骤（2）的PCR产物，加入0.1倍体积的饱和醋酸钠和3倍体积的乙醇，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀加入200μl体积浓度70%乙醇清洗，12000转/分钟离心10分钟，弃掉上清液，沉淀室温晾干，再加入10μl无菌去离子水溶解PCR产物；

（4）、按照酵母转化法，将步骤（3）回收的PCR产物电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在含100μg/mL博来霉素的YPDS培养基平板上筛选阳性克隆；

所述的YPDS培养基平板是：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂20g和1M山梨醇制成，溶解酵母膏、蛋白胨于900mL水中，加入琼脂，加入葡萄糖、1M山梨醇溶解至1L，115℃灭菌15min，即成；

（5）、提取酵母基因组DNA：挑选步骤（4）任意的5-10个阳性克隆，分别转入由0.2M乙酸锂和质量浓度1%十二烷基磺酸钠制成的裂解液100µL中重悬细胞，75℃加热10分钟，加入300µL无水乙醇，混匀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀加入400µL体积浓度70%乙醇漂洗沉淀，12000转/分钟离心5分钟，除去上清液，沉淀室温晾干，加入50µL无菌水溶解沉淀，12000转/分钟离心5分钟，以上清液为模板，用引物GAP-F 5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA 3'、3’AOX1 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC3'和高保真DNA聚合酶进行聚合酶链式反应，再对PCR产物进行测序，计算碱基突变率、基因突变率，满足实验需求，根据需要进行突变克隆筛选，实现快速构建蛋白质突变体毕赤酵母表达文库，突变率的计算公式是：

突变率=碱基突变总数/（测序克隆数×基因总碱基数）×100%。