[发明专利]一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法

说明书

本发明涉及线虫保存技术领域，具体涉及一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法。本发明提供的扩散型3龄松材线虫的低温保存方法包括采用氯化钾溶液处理扩散型3龄松材线虫，再进行低温保存的步骤。本发明针对扩散型3龄松材线虫提供适宜的低温保存方法，该方法先对扩散型3龄松材线虫进行渗透脱水处理，再进行低温保存，显著提高了扩散型3龄松材线虫在低温保存过程中的存活率；经低温保存的扩散型3龄松材线虫只需经过复水处理即可复活，经过常规培养后即可转化为繁殖型松材线虫。该保存方法不需要使用冷冻保护剂，不依赖复杂的程序性降温方法，具有操作简单、成本低廉的优势，适于推广应用。

技术领域

本发明涉及线虫保存技术领域，具体涉及一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法。

背景技术

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)属于线虫动物门、线虫纲、滑刃目、滑刃科、伞滑刃属，可引起松树枯萎病(Pine Wilt Disease)。松树枯萎病是最具危险性的森林病害之一。随着气温降低，松树体内温度随之降低，新陈代谢速率开始减慢，同时体内的松材线虫由繁殖型幼虫向扩散型3龄幼虫转化。扩散型3龄松材线虫是松材线虫抵抗不利环境形成的虫态，也是松材线虫生活史的幼虫阶段之一。

线虫在极端环境条件下可进行休眠，线虫休眠的意义是抵抗低温等极端环境，延长生命周期。多种线虫在渗透压胁迫条件下可进入脱水休眠状态，有线虫休眠超过3万年的记录。脱水休眠过程是指线虫通过逐渐脱水进入隐生状态，此状态运动停止，新陈代谢降低，生命周期处于暂停阶段。在适宜条件下脱水休眠的线虫可通过复水重新恢复活力。

目前报道的松材线虫的保存方法均需使用冷冻保护剂，且多针对繁殖型松材线虫。繁殖型松材线虫是松材线虫在正常环境中的幼虫形态，与扩散型3龄松材线虫存在较大差异。专利申请CN 102428909 A公开了一种松材线虫的冷冻保存及解冻方法，该方法先对松材线虫悬液进行预处理在将处理后的松材线虫悬液中加入冷冻保护剂，进行平衡处理，然后将平衡处理后的松材线虫悬液进行程序化降温后冷冻保存。

发明内容

本发明的目的是提供一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法，利用该方法进行扩散型3龄松材线虫的低温保存能够显著提高扩散型3龄松材线虫的存活率。

本发明以扩散型3龄松材线虫为研究对象，通过对含有扩散型3龄松材线虫的油松木段进行分析，发现在寄主体内的扩散型3龄松材线虫能够长期在-20℃低温条件下保证较高的存活率。然而，扩散型3龄松材线虫离开寄主后，其在低温条件下的存活率明显降低。本发明发现利用渗透调节可以使得扩散型3龄松材线虫进入隐生状态，进一步根据冬季松树体内温度、水分和无机盐离子的变化规律设计低温胁迫实验，发现人工渗透调节使得扩散型3龄松材线虫进入隐生状态后，可在-20℃环境中显著提高其存活率，基于此，本申请开发了能够显著提高扩散型3龄松材线虫的存活率的脱水休眠低温保存方法。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种扩散型3龄松材线虫的低温保存方法，该方法包括采用氯化钾溶液处理扩散型3龄松材线虫，再进行低温保存的步骤。

本发明对渗透调节物质进行了大量的筛选，意外地发现，与其他溶液相比，利用氯化钾溶液处理扩散型3龄松材线虫，能够显著提高扩散型3龄松材线虫的低温保存存活率。

本发明对氯化钾溶液的浓度进行了筛选，发现采用特定浓度的氯化钾溶液更有利于提高扩散型3龄松材线虫的低温保存存活率。

优选地，所述氯化钾溶液的浓度≤8％。

进一步优选地，所述氯化钾溶液的浓度为3-8％。更优选的氯化钾浓度为6-8％。

作为本发明的最优选实施方式，所述氯化钾溶液的浓度为8％。