[发明专利]一种许氏平鲉IL-1β重组蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种许氏平鲉IL‑1β重组蛋白，包含：IL‑1β成熟肽氨基酸序列，以及连接到所述IL‑1β成熟肽氨基酸序列的N端的标签肽段，所述标签肽段包含组氨基酸标签序列和促溶标签序列。本发明还提供了编码该重组蛋白的基因、表达该重组蛋白的载体和重组工程菌。本发明还进一步提供了基于该重组蛋白制备许氏平鲉IL‑1β蛋白的方法，以及该重组蛋白或制备的许氏平鲉IL‑1β蛋白在许氏平鲉育种中的应用。本发明的重组蛋白可通过原核细菌大量诱导表达获取可溶性重组蛋白，有利于后续工业化提取和纯化，并且重组蛋白可酶解为许氏平鲉IL‑1β蛋白，且具有活性，能够有效的用于许氏平鲉育种。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种大肠杆菌表达系统生产可溶的、有生物活性的许氏平鲉白介素1β(IL-1β)重组蛋白及其在许氏平鲉育种中的应用。

背景技术

许氏平鲉(Sebastes schlegelii)隶属于鲉形目(Scorpaeniformes)、平鲉科(Sebastidae)、平鲉属(Sebastes)，是我国北方重要的冷温性经济鱼类之一。许氏平鲉繁殖方式为卵胎生，雌雄发育不同步，雄鱼于每年11月性成熟(雌鱼此时未熟)，雌雄鱼在11-12月完成交配，精子在雌鱼体内可储存4个月，并在次年3-4月雌鱼卵巢成熟，发生体内受精，胚胎在雌鱼体内发育大约1个月时长，于4月末至5月初分娩产出仔鱼。

卵胎生硬骨鱼的分娩属于典型的自发性炎症反应，白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)属于一种典型的炎症因子，在分娩中IL-1β基因(il1b)及其主要受体IL1R1基因(il1r1)相对表达水平达到最高，并在分娩24h后显著下调(P＜0.05)。IL-1β可通过直接通过NF-κB细胞通路上调前列腺素合成酶COX2基因(cox2)的表达水平，提高前列腺素的水平，间接调控分娩进程。在许氏平鲉育苗中，雌鱼若状态不佳，容易发生难产而死亡。因此可通过注射IL-1β蛋白促进分娩进程。不同于其他内质网、高尔基体途径分泌的蛋白质，脊椎动物的IL-1β前体肽在溶酶体中被Caspase 1切割活化得到IL-1β成熟肽，进而胞吐分泌至胞外，成熟肽不含二硫键也不具备蛋白翻译后修饰，因此，使用原核表达系统生产许氏平鲉或其他脊椎动物的IL-1β重组蛋白是最优选择。

在基因工程领域中，大肠杆菌(Escherichia coli)是原核表达系统常用的工程菌，属于一种兼性厌氧革兰氏阴性菌，其生长周期短，遗传背景清晰，培养操作简单、成本低廉，可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。通过使用强力的启动子(如T7/lac、Tac等)，外源蛋白表达可在大肠杆菌中高水平表达，表达量最高可达菌体总蛋白的40-50％。但是，大肠杆菌表达外源蛋白的速率远远高于真核生物，重组蛋白表达速率过快，新生肽链常常不能及时正确折叠，而错误折叠的蛋白疏水部分暴露、相互聚集，形成无活性包涵体。

包涵体形成是原核表达中的常见问题。目前已有草鱼等少数硬骨鱼类IL-1β重组蛋白原核表达的报道。然而，这些报道中IL-1β重组蛋白均为无活性的包涵体，需要繁琐的变复性操作才能恢复生物活性，技术路线如下：在洗涤包涵体后，通过添加高浓度变性剂(尿素或盐酸胍)溶解无活性包涵体，使用His6或者strep II等融合标签在变性条件下亲和纯化，再通过稀释复性/透析复性/柱上复性等技术使变性的目的蛋白重折叠而恢复活性。

鉴于包涵体变复性操作繁琐，需要摸索复性蛋白浓度、离子环境以及氧化还原对的比例浓度，并且复性过程耗时较长，变性剂尿素可能对蛋白有不利影响。因此如何使用大肠杆菌表达可溶的、有活性的重组蛋白具有现实意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种许氏平鲉IL-1β重组蛋白，包含：IL-1β成熟肽氨基酸序列，以及连接到所述IL-1β成熟肽氨基酸序列的N端的标签肽段，所述标签肽段包含组氨基酸标签序列和促溶标签序列。优选地，所述IL-1β成熟肽氨基酸序列为SEQ IDNO:1。