[发明专利]一种泛解酸内酯水解酶突变体菌株及其应用

说明书

本发明提供了一种泛解酸内酯水解酶突变体菌株及其应用。具体地，本发明提供了一种酶活显著提高的突变型泛解酸内酯水解酶以及表达该突变型泛解酸内酯水解酶的宿主细胞。本发明还提供了包含所述突变型泛解酸内酯水解酶的酶制剂，可以将底物DL‑泛解酸内酯中的D‑泛解酸内酯完全水解为D‑泛解酸，转化率高，性质稳定，且能够重复使用，适用于工业化生产。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地涉及一种泛解酸内酯水解酶突变体菌株及其应用。

背景技术

泛酸是B族维生素，辅酶A的主要原料，参与人体和动物体内的重要代谢，包括脂肪酸降解与合成、柠檬酸循环、胆碱乙酰化、抗体的合成，促进营养物质的吸收和利用。泛酸不稳定，其商品形式主要以D-泛酸钙(右旋体)形式存在，D-泛酸钙广泛用于医药、食品、饲料工业，尤其是作为食品和饲料添加剂的需求量巨大。

D-泛解酸内酯是制造D-泛酸的重要手性中间体，获得D-泛解酸内酯的方法主要包括化学拆分法和微生物酶法。其中化学方法拆分法因成本高、产量小、分离困难、产品光学纯度差等缺点而逐渐式微。

微生物酶法拆分最常用的是利用产D-泛解酸内酯酶的微生物选择性水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯得到D-泛解酸，再将D-泛解酸进行内酯化生成D-泛解酸内酯，该方法因水解时间短，且未水解的L-泛解酸内酯可加碱消旋后可再利用，而成为目前的主流方法。此法最早由日本的Fuji公司申请专利[US5275949]，并在日本第一制药公司全球率先实现工业化生产，国内浙江鑫富生化股份有限公司[CN1313402A、CN1793321A]、浙江新和成股份有限公司[CN108004291A]等也都采用了同样的工艺路线。

目前世界30％的D-泛酸盐是通过酶催化过程产生，其中镰孢菌属因其良好的催化性能而应用广泛，例如尖镰孢霉菌(Fusarium Oxysporum)、串珠镰孢霉菌(Fusariummoniliforme)以及轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)，提高其酶活主要是通过传统诱变方式及培养基优化。随着分子生物学技术的发展，D-泛解酸内酯水解酶在基因工程领域的研究也有了较大进步，1998年日本Kobayashi等对尖镰孢霉菌AKU 3702菌株中的D-泛解酸内酯水解酶基因进行研究，首次报道其核苷酸及氨基酸序列，并将该酶基因与载体连接后转入大肠杆菌进行表达[Michihiko Kobayashi等,1998]；2005年报道的文献中Kohsuke Honda等人进一步将该基因在米曲霉中进行表达，湿菌体4h可将20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液中的D型内酯转化为D-泛解酸，转化率为49.9％[Kohsuke Honda等，2005]；江南大学报道的专利CN1597962A将D-泛解酸内酯水解酶基因进行密码子优化后构建成重组表达质粒，转化至大肠杆菌或酿酒酵母中进行过表达，重组大肠杆菌酶活力达37-41U/g，重组酿酒酵母酶活力达60-64U/g；专利CN109456908A将来源于串珠镰孢霉菌CGMCC 0536菌株的D-泛解酸内酯水解酶的编码基因转入乳酸克鲁维酵母细胞，获得产酶菌株，酶活3-5U/mL。

然而，现有技术中的D-泛解酸内酯水解酶还不足以满足工业生产的需求，本领域需要开发新的酶活更高的D-泛解酸内酯水解酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种泛解酸内酯水解酶突变体菌株及其应用。尤其是提供基因定点突变提高酶活的菌株优化方法。提供产酶菌株发酵培养、固定化、包埋方法以及酶活测定方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种突变型泛解酸内酯水解酶，所述突变型泛解酸内酯水解酶与野生型泛解酸内酯水解酶相比，在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的选自下组的一个或多个位点的氨基酸残基发生突变：第127位、第128位、第129位、第130位和第132位。

在另一优选例中，所述突变型泛解酸内酯水解酶与野生型泛解酸内酯水解酶相比，在对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第127位、第128位、第129位、第130位和第132位发生突变。