[发明专利]一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法

说明书

本发明公开了一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，包括以下步骤：步骤一：从年龄18至30岁的健康志愿者中提取出没有龋齿和牙周病变的第三磨牙，用75％酒精牙齿表面进行消毒，随后使用牙科钻头取出牙髓；步骤二：将牙髓用消毒后的小刀切成1mm的小块，共三小块；步骤三：用含有2.5％抗生素的PBS冲洗3次，随后将牙髓组织放入1.5mlEP管中用3mg/ml的I型胶原酶消化‑4mg/mL的分散酶37℃放置30分钟；通过对牙髓干细胞进行糖氧剥离处理，可以有效的促进牙髓干细胞分泌更多外泌体，促进了牙髓干细胞的外泌体在医学临床的应用。

技术领域

本发明属于牙髓干细胞技术领域，具体涉及一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法。

背景技术

牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织。2000年Gronthos等通过对人牙髓细胞的研究，发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞中形态呈梭形，可自我更新和多向分化，有着较强的克隆能力。这些由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞就称为牙髓干细胞(DentalPulpStemCells,DPSCs)。

外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。

目前牙髓干细胞的外泌体的提取方法主要有超速离心法、密度梯度离心、色谱法、磁珠免疫法、多聚物沉淀法。然而无论哪种方法，外泌体获取的量仍较少，这限制了外泌体的临床应用，如何使牙髓干细胞分泌更多的外泌体值得进一步研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，以解决上述背景技术中提出的目前牙髓干细胞的外泌体的提取方法获取的外泌体量较少，限制了外泌体的临床应用的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种提升牙髓干细胞分泌外泌体能力的方法，包括以下步骤：

步骤一：从年龄18至30岁的健康志愿者中提取出没有龋齿和牙周病变的第三磨牙，用75％酒精牙齿表面进行消毒，随后使用牙科钻头取出牙髓；

步骤二：将牙髓用消毒后的小刀切成1mm的小块，共三小块；

步骤三：用含有2.5％抗生素的PBS冲洗3次，随后将牙髓组织放入1.5mlEP管中用3mg/ml的I型胶原酶消化-4mg/mL的分散酶37℃放置30分钟；

步骤四：将牙髓细胞重悬至5％CO2温箱中培养(培养基：DMEM+10％的胎牛血清+100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素)，温度设置为20-40℃，5天之后换液，之后每3天更换一次；

步骤五：待到第一代细胞融合至80％左右后，消化离心处理后，取出5000个左右细胞在45孔板中进行种植并进行免疫荧光鉴定，剩余细胞均匀种植在两个100mm的培养皿中，将两组细胞分别命名为对照组和实验组；

步骤六：将牙髓干细胞接种在100mm培养基中，待到细胞融合至80％左右后，将对照组的培养基去除，用PSB清洗三次后更换为无血清DMEM培养基，将实验组的培养基更换为无糖DMEM培养基，并将培养皿置于厌氧培养罐(三菱产气罐AnaeroPackTM)(37℃、100％CO2、)中继续培养90min后，将培养板中的无糖DMEM更换为DMED培养基并置于普通培养箱继续培养48小时；