[发明专利]固定化精氨酸消旋酶及其制备方法、应用

说明书

本发明公开了固定化精氨酸消旋酶及其制备方法、应用，固定化精氨酸消旋酶的制备方法，包括以下步骤：S1、将产精氨酸消旋酶的大肠杆菌发酵液制备成重悬液；S2、将步骤S1获得的重悬液依次经过破胞、絮凝获得粗酶液；S3、向步骤S2获得的粗酶液中加入环氧型固定化酶载体，搅拌，加入三水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾固体，继续搅拌固定化，一段时间后进行固液分离，获得固定化精氨酸消旋酶。本方法制备的固定化精氨酸消旋酶与游离精氨酸消旋酶酶相比具有更佳的热稳定性、保存稳定性。本方法制备的固定化精氨酸消旋酶催化L‑精氨酸生成DL‑精氨酸方法简单，后处理工艺步骤少且固定化酶可以重复使用，大大降低了转化成本，特别适合大规模工业化生产。

技术领域

本发明涉及酶催化技术领域，具体涉及固定化精氨酸消旋酶及其制备方法、应用。

背景技术

DL-精氨酸是L-精氨酸的消旋体，对成人为非必需氨基酸，但体内生成速度较慢，对婴幼儿为必需氨基酸，有一定的解毒作用，其作为D-精氨酸的生产原料，在医药化工领域有着相当广泛的应用。

目前，DL-精氨酸的制备方法有化学合成法和生物酶催化法。文献报道涉及L-精氨酸化学法消旋的方法主要是以水杨醛为催化剂，在冰乙酸溶液中消旋L-精氨酸制备DL-精氨酸。生物酶催化法主要以含精氨酸消旋酶的大肠杆菌全细胞催化L-精氨酸生成DL-精氨酸。化学消旋法用到的水杨醛和冰乙酸对呼吸道有刺激性，吸入后引起咳嗽、胸痛，对眼和皮肤有刺激性且水杨醛可燃，有毒，遇高热、明火及强氧化剂易引起燃烧并放出有毒气体。生物酶全细胞催化法虽然避免了有毒有机试剂的使用，但存在酶不可回收重复利用的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供固定化精氨酸消旋酶及其制备方法，将制备的固定化精氨酸消旋酶用于合成DL-精氨酸，不仅避免了化学消旋过程中有毒有机试剂的使用，又解决了全细胞催化法酶不可回收重复使用的问题。

本发明通过下述技术方案实现：

固定化精氨酸消旋酶的制备方法，包括以下步骤：

S1、将产精氨酸消旋酶的大肠杆菌发酵液制备成重悬液；

S2、将步骤S1获得的重悬液依次经过破胞、絮凝获得粗酶液；

S3、向步骤S2获得的粗酶液中加入环氧型固定化酶载体，搅拌一段时间后，加入三水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾固体，继续搅拌固定化一段时间后进行固液分离，获得固定化精氨酸消旋酶。

本发明所述环氧型固定化酶载体采用市售商业性环氧基酶载体，含有环氧基，粗酶液中的精氨酸消旋酶表面含有可与环氧基共价结合的氨基酸残基，本发明的构思在于：

利用环氧基酶载体的环氧基和精氨酸消旋酶表面的氨基酸残基的共价结合，使酶蛋白稳定且不可逆的固定在环氧基酶载体上。

通过本发明所述方法制备的固定化精氨酸消旋酶用于制备DL-精氨酸与全细胞催化法相比，虽然单次转化率不如全细胞催化高，但可重复使用，累计总转化率远高于全细胞催化法。1g湿菌体用于全细胞转化24h最大极限为消旋70gL-精氨酸，将1g湿菌体所含的酶制成固定化酶在相同条件下转化单次最大极限为消旋50gL-精氨酸，可重复使用5次，若降低底物浓度或延长转化时间，固定化精氨酸消旋酶还可继续使用。为了延长固定化精氨酸消旋酶的使用寿命以获得最大的总产量，在具体实施例中不以单次极限转化率为条件。

进一步地，步骤S3中，搅拌的温度为25-37℃，时间为1h。

进一步地，步骤S3中，

所述三水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的加入量以使体系中磷酸盐浓度达到1-2M/L，pH值达到7.0-8.0为计。

进一步地，步骤S3中，固化时间为18-24h。

进一步地，步骤S1中，重悬液的制备过程如下：