[发明专利]一种香蕉采后果实eATP水平的检测方法

说明书

本发明涉及一种香蕉采后果实eATP水平的高效检测方法，包括：对香蕉绿熟果实的统一预处理；香蕉果皮圆片组织的标准化制作；ATP检测工作液的准备；eATP标准曲线的测定和计算；萃取样品中eATP的高效测定与计算。本发明以香蕉为实施例，通过制作香蕉果皮组织中圆片来萃取eATP，利用化学发光仪（Luminometer）检测萤光素酶催化ATP所产生的RLU荧光值的原理，来检测果蔬衰老和应激反应过程中的eATP水平，具有灵敏度高、操作简单、重复性好、测定成本低等优点。

技术领域

本发明涉及植物生理学领域，具体涉及一种香蕉采后果实eATP水平的高效检测方法。

背景技术

腺苷三磷酸 (ATP)是所有活细胞内生化反应和信号传递过程的能量通货，同时可通过胞吞胞吐、通道蛋白等途径排到细胞外成为细胞外ATP（eATP），发挥重要的信号分子作用，参与植物的生长发育过程，并且作为一种损伤相关模式分子(Damage associatedmolecular pattern，DAMP)，植物逆境胁迫过程中发挥重要作用（Choi等，2014；Jiang等，2007；Li等，2018） 。果实成熟是由内部和环境因素引发的一个活跃的过程，而细胞内的能量状态（iATP）和细胞外的eATP变化是果实成熟和贮藏过程中的一个重要特征。大量实验研究表明，确保足够的细胞内ATP供应和适宜浓度的细eATP信号，延缓采后衰老，减轻胁迫损耗，并保持品质和延长货架期（Aghdam等，2018）。外源ATP处理可以减弱许多园艺产品的采后胁迫的影响和延缓采后衰老，例如荔枝（Yi等，2010）、龙眼（Zhang等，2017）、康乃馨（Song等，2014）以及豆芽（Chen等，2018）。因此，如何维持采后果蔬细胞内足够的iATP和适宜浓度的eATP是开发设计保鲜技术的重要依据。虽然关于如何测定植物组织细胞内的ATP已有大量方法报道，但是关于如何测定植物eATP的方法较少。

近年来，科学家们发明了非损伤微电极检测法来实时检测eATP水平，具体操作为制作精密的金属电极外包裹了以ATP为底物的生物酶层（例如甘油激酶和磷酸甘油氧化酶、己糖激酶和葡萄糖氧化酶等氧化还原酶系统），通过借助于显微镜以及显微操作系统，使电极充分接近待测细胞或组织，在ATP 存在时，电极表面发生氧化还原反应，产生电子转移，将化学信号转换成电信号，通过检测电信号的变化而间接测定ATP的浓度（Compagnone andGuilbault，1997；Kueng等，2004；Llaudet等，2005），主要应用于测定了神经细胞、爪蟾胚胎等细胞中的eATP（王浩然 等，2017）。虽然在2015年，Vanegas等首次将该方法应用于植物细胞，测定了水蕨孢子光诱导下以及玉米根在触碰以及损伤时释放的ATP，但实验操作体系不完善，存在操作复杂、重复性差、测定成本高等问题，并且此项技术目前在植物学研究领域内的应用非常有限，对于体积较大、形状不规则的植物组织或器官，例如香蕉以及其它果实等组织则难以利用此项技术探究其生理活动规律。

事实上，一方面，由于香蕉是一种典型的呼吸跃变型水果，其品质的形成在很大程度上取决于采后后熟，而后熟过程中需经历了一系列生理生化变化，包括颜色转黄、软化、淀粉降解和香气形成（Liu等，2009），并且香蕉果实容易受到冷害等胁迫，与细胞内的能量水平密切有关（Li 等，2015；Liu等，2019；Wang等，2015）。因此，香蕉果实是研究eATP在果蔬衰老和应激反应中的生理作用的理想材料。另一方面，D-荧光素在ATP以及萤光素酶的催化作用下，被氧化发光，在化学发光仪（Luminometer）测定荧光RLU值，灵敏度高，具有操作简单、测定成本低等优点。而且，至今还未见通过标准化制作香蕉果皮组织中圆片萃取eATP，基于化学发光仪（Luminometer）/萤光素酶方法测定eATP水平的的方法的相关报道和专利公布。

发明内容

本发明的目的在于提供一种香蕉采后果实eATP水平的高效检测方法，以克服现有技术中存在的缺陷。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种香蕉采后果实eATP水平的高效检测方法，按照如下步骤实现：

步骤S1：对香蕉绿熟果实的统一预处理；