[发明专利]一种选择性检测半胱氨酸荧光探针的合成与应用

说明书

本发明公开了一种选择性检测半胱氨酸（Cysteine,Cys）的荧光分子探针，该分子探针的化学结构式如下：。该荧光探针能与Cys发生取代‑重排‑环化级联化学反应，与Cys反应后在380 nm激发波长下发射472 nm的强蓝色荧光，对其他含硫氨基酸等生物分子无明显荧光响应，利用该识别机理实现了选择性检测Cys，且灵敏度高（检测限为0.5 nM）。本发明公开的荧光分子探针能够用于体外环境中定量Cys和活细胞中Cys的荧光成像分析。

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种可选择性检测Cys荧光探针的合成，以及该探针在环境中定量检测Cys，在细胞内荧光成像Cys的应用。

背景技术

半胱氨酸（Cysteine，Cys）是二十种天然氨基酸中唯一含有还原性巯基的氨基酸，是细胞中硫代谢的中心物质。细胞内的Cys主要由三条途径获得，胱氨酸还原、蛋氨酸代谢和体内蛋白质分解。由于血浆中较高的氧化环境，Cys在血液系统中主要以二硫键的氧化态（Cyss）形式存在，Cys和Cyss的动态平衡是血液系统中氧化还原稳态的主要调节因素。血浆中总Cys的含量约为250 μM，且其随年龄、胆固醇、性别等因素的不同略有变化。血浆中的Cyss经细胞膜上Xc-通道进入细胞后在细胞内被还原为Cys，Cys在细胞内进一步参与蛋白质、GSH的合成以及分解代谢（细胞中总Cys的浓度为30-200 μM）。在动物细胞中，Cys参与了肽链的合成和折叠、氧化还原平衡调控、细胞信号传导、解毒、凋亡等大量生命过程，在生命系统中有着不可或缺的重要地位。其在肌体内的浓度异常与心脑血管疾病、神经退行性疾病、癌症等重大疾病的发病密切相关。因此，通过实时监测细胞内Cys含量对深入了解其生物学作用机制与功能、指导药物开发具有重要意义。

近年来，荧光探针因其能够监测和可视化活细胞中的分析物而受到广泛的关注，因其提供了一种非破坏性、高选择性与灵敏度、可视化、操作简便的分析方法。截至目前已报道了很多基于丙烯酸酯/醛基为识别基团的荧光探针用于检测Cys，但这些分子探针存在选择性差（同型半胱氨酸和谷胱甘肽有一定的干扰）、灵敏度低的缺点。因此，发展高特异性的识别位点/基团用于高选择性检测Cys，对深入了解Cys的生物学功能与相关机制具有非常重要的意义。

发明内容

鉴于上述情况，克服一些现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高选择性检测Cys的荧光探针，利用Cys与探针发生取代-重排-环化级联反应机理，实现高选择性检测Cys的目的，为环境中定量Cys和活细胞中成像分析Cys提供可靠的分析工具与方法。

本发明的目的还在于提供一种选择性检测Cys的荧光分子探针的合成与应用方法。

本发明解决问题采取的具体技术方案为：一种选择性检测半胱氨酸荧光探针的合成与应用，探针的化学结构式如下：

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一种选择性检测Cys荧光探针的合成，其特征在于，所述荧光分子探针的合成方法包括以下步骤：

步骤1.合成(氰基甲基)三苯基溴化膦

将适量溴乙氰与三苯基膦加入乙酸乙酯中，回流反应2小时，过滤干燥得白色固体(氰基甲基)三苯基溴化膦；

步骤2.合成(E)-3-（9-氯-11-氧代-2,3,6,7-四氢-1H,5H,11H-吡喃并[2,3-f]吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-10-基）丙烯腈

a. 将适量9-氯-11-氧代-2,3,6,7-四氢-1H,5H,11H-吡喃并[2,3-f]吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-10-甲醛与(氰基甲基)三苯基溴化膦加入二氯甲烷中，室温搅拌反应30分钟，

b. 将适量NaOH溶于H₂O中，缓慢滴加入步骤a的反应液中，继续室温搅拌反应5小时，