[发明专利]π-FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用

说明书

本发明涉及一种π‑FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用，所述探针组合物由四步杂交的单链DNA探针组成，分别为一级π型探针、二级探针、三级探针和信号探针；本发明克服了传统荧光原位杂交，探针特异性不高、信号背景噪音大、操作复杂、步骤繁琐、信号放大能力低等缺陷，只需要简单的几步逐级放大探针杂交就能实现对细胞、组织中RNA或DNA核酸信息的原位、单分子检测，在精度、通量和成本上显著优于传统荧光原位杂交方法。

技术领域

本发明涉及核苷酸的原位单分子检测技术领域，具体涉及一种π-FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用。

背景技术

1969年，Gall和Pardue利用放射性标记的探针最早实现原位解读核酸信息(Pardue 1969)，但是这种方法有很多缺陷。首先，放射性标记探针是一种相对昂贵和危险的材料，储存和处理上都不稳定；其次，该方法背景高，自显影时间长，空间分辨率不高(Levsky and Singer 2003)。因此，这种方法很快就被基于荧光标记的技术所取代。1986年，Pinkel等人使用生物素分子或地高辛偶联的DNA探针，进而利用结合在亲和素上的报告分子或通过抗地高辛的抗体进行可视化，提高了目标核酸分子检测的速度和准确性。这种以非放射性荧光标记取代放射性同位素标记检测核酸分子的新型原位杂交方法即荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)方法得以快速发展起来。

FISH本质上是将核酸探针与细胞或组织中的目标DNA或RNA的互补序列进行杂交，通过荧光直接标记的杂交互补探针，或通过非标记的杂交互补探针结合报告分子进而借助荧光标记的检测探针或其他亲和分子，可以最终实现目标核酸的原位检测(Volpi andBridger2008)。FISH技术的出现已经被广泛应用于临床诊断和生命科学包括神经科学、毒理学、微生物生态学、比较基因组学、细胞基因组学和染色体生物学等领域的研究，如研究DNA的复制、RNA的加工和基因的表达、物种间保守序列和物种间的染色体重排等等(Nathand Johnson 2000,Volpi et al 2008)。该项技术使得人类对染色体结构和功能的解析进入了一个新时代，开启了对空间组学探索的大门。

FISH技术中的信号呈现方法最常用的是基于半抗原形式的经典荧光原位杂交技术，其基本原理是：将带有特定标记的(如生物素、地高辛等)核苷酸单链片段作为探针，与组织切片或细胞内待测核酸片段进行杂交，在一定的条件下，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA双键分子，实现核酸检测的目的，但是该方法操作步骤复杂、程序繁琐、杂交信号特异性不是很高。

近年来经过不断的优化与改进，衍生出了许多不同的FISH方法，然而价格昂贵、操作繁琐、检测信号灵敏度不高、特异性不够、背景较强、杂交效率低仍是限制该技术发展的瓶颈。此外，目前的FISH对中高拷贝数的靶分子检测比较有效，对于低拷贝数甚至单拷贝靶分子的检测仍束手无策。随着单细胞技术的发展，核酸的原位检测在精度和通量上有了更高的要求，如何在单个细胞内实现单个分子精度和多个基因的同时检测是目前需要解决的棘手问题。传统的FISH由于信号放大能力有限，在单个分子检测上仍难以实现，除非设计多个荧光互补探针，但成本将大大提高。

因此，亟需开发出一种高灵敏性、高特异性、高通量、低成本的FISH技术，来实现核酸的原位、单分子、高通量检测，助力临床精准诊断和生命科学的精细化水平研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种π-FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用，该π-FISH定位单分子的探针组合物能够有效地能够实现细胞、组织中DNA和RNA的原位、单分子定性与定量检测；该方法具有通量高、特异性好、信号放大能力强、空间分辨率高、背景噪音低、低成本、操作简单等优点，本发明只需要四步探针杂交就实现RNA或DNA的原位、单分子检测，在精度、通量和成本上显著优于传统荧光原位杂交方法。