[发明专利]一种恶臭假单胞菌烯醇酶基因克隆方法与应用

权利要求书

1.一种恶臭假单胞菌烯醇酶基因克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取恶臭假单胞菌总DNA；

2)以提取的总DNA为模板，以上游引物P1和下游引物P2为特异性引物，通过PCR扩增获得目的片段；P1和P2的序列为：

P1：GATAAGCTTGTATGGCAAAAATCGTCG

P2：CATCTCGAGTTAGCCGCGAAACTC

3)将目的片段与表达载体pET28a经HindIII/XhoI双酶切，T4连接酶16℃过夜连接，

获得重组质粒pET28a-eno；

4)将重组质粒pET28a-eno转化大肠杆菌感受态细胞中，获得重组菌；

5)将重组菌通过Kan抗性筛选阳性转化子；

6)挑取单菌落接种于含有Kan的培养液中培养过夜；按1-3％接种量转接于新鲜的LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.5，加入终浓度为0.2-1mM的IPTG，于20-30℃培养4h；8000rpm离心，收集菌体。

2.根据权利要求1所述的一种恶臭假单胞菌烯醇酶基因克隆方法，其特征在于，步骤2)中，PCR扩增体系是：ddH₂O 32.5μl，10×PCR Buffer 5μl，Mg²⁺ 5μl，dNTP Mixture 4μl，模板DNA 1μl，上游引物P1(25μM)1μl，下游引物P2(25μM)1μl，pfu DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl。

3.根据权利要求1所述的一种恶臭假单胞菌烯醇酶基因克隆方法，其特征在于，步骤2)中，PCR扩增条件是：95℃预变性8min；95℃变性45s，63℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种恶臭假单胞菌烯醇酶基因克隆方法，其特征在于，步骤4)中，加入IPTG至终浓度为1mM。

5.根据权利要求1所述的一种恶臭假单胞菌烯醇酶基因克隆方法，其特征在于，步骤4)中，于30℃培养4h。

6.按照权利要求1-5任意一项所述的方法获得的菌体在生物柴油副产物甘油合成PHA中的应用。