[发明专利]一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法

说明书

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法。包括以下步骤：(1)分离和培养人源脐带间充质干细胞；(2)将质粒、供体DNA、脂质体加入到步骤(1)得到的培养液中进行转染；(3)将步骤(2)转染后的人源脐带间充质干细胞转入含青霉素、链霉素的人源脐带间充质干细胞培养基进行培养；(4)将步骤(3)培养后的人源脐带间充质干细胞进行筛选培养；(5)将步骤(4)培养后的人源脐带间充质干细胞消化传代，待扩增至获得稳传的细胞株即可。与现有技术相比，本发明能明显促进间充质干细胞增殖速度快1倍，延缓其细胞衰老进程达50％的效率。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种通过FOXP1基因编辑和突变延缓间充质干细胞衰老的方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种非造血系统的成体多能干细胞，Friedenstein最早提出MSCs的概念，用于定义一群干细胞，可以在体外形成成纤维细胞克隆聚落(CFU-F)，还能进行成骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞三系分化(Friedenstein etal.，1966)。它具有高度的自我更新能力，同时具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的能力(Caplan,2017)。大部分研究将成骨、成脂肪和成软骨的三系分化能力作为定义间充质干细胞的“金标准”(Bianco et al.，2008b)。MSC细胞表面标记包括CD73，CD90和CD105，但不表达CD11b，CD14，CD34，CD45，和HLA-DR。

目前，MSCs已经被广泛应用于组织损伤修复，退行性疾病治疗和免疫抑制的研究(Trounson and McDonald,2015)。截止到2020年目前，世界范围内在ClinicalTrials.gov上登记的MSCs相关的临床试验已超过930项，其中国内的超过200项。MSC可以用来移植治疗各种疾病(Ankrum and Karp，2010；Newman et al.，2009；Uccelli et al.，2008)，包括关节损伤(Barry，2003)；心肌缺血(Amado et al.，2005)，成骨发育不全症(Horwitz et al.，2002)，移植免疫排斥(Newman et al.，2009)等。

目前这些MSCs细胞治疗效果并不理想，在临床上广泛应用存在障碍，主要有如下原因：其一，原代的MSCs来源和数量有限，其次依靠传统方法从骨髓，脐带血等组织分离的MSCs，其细胞群体异质性比较大；同时体外扩增容易出现增殖性衰老(replicativesenescence)，移植入体内的MSCs存活时间短(Mao et al.,2019)，不能有效地修复受损的组织(Duffield et al.,2005)。MSC体外传代培养过程中，前6-8代细胞相对正常(Khoo etal.，2008)，但长时间传代培养容易导致形态和分化能力发生改变，如MSC传代10-15代后，它仍能保留成骨分化的潜能，但成脂分化能力却丧失了(Digirolamo et al.，1999)。人源MSC的传代培养还会导致增殖潜力的不断下降，端粒长度缩短等衰老症状(Baxter et al.，2004；Digirolamo et al.，1999；Mets and Verdonk，1981)。这些体外培养导致的MSC衰老和增殖潜力下降，限制了MSC的移植和临床治疗应用。

我们的前期研究发现，FOXP1是一类新型的MSCs抗衰老因子(Li et al.,2017)。FOXP1在MSCs中的表达水平，随衰老进程而下降。FOXP1蛋白可能通过直接抑制p16INK4a的表达，调控MSCs的衰老。在人源脐带间充质干细胞s细胞当中过表达FOXP1基因，能明显促进MSCs自我更新和增殖，延缓其衰老进程。通过细胞生物学或遗传学方法，改变MSC细胞当中衰老相关基因的表达水平，可以通过病毒载体，哺乳动物细胞表达质粒等方法转染细胞。我们根据这些发现，已经申请了专利(201611085228.0)，通过病毒和表达质粒等方式过表达FOXP1，延缓MSCs的衰老。