[发明专利]规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法及其应用

权利要求书

1.一种规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法，其特征在于：所述规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法采用基因编辑技术敲除鱼类的性类固醇激素合成通路的催化酶编码基因，用以阻断鱼类的性类固醇激素合成通路，并筛选获得有效突变的杂合子雌鱼和XX性别遗传型的伪雄鱼，再将所述伪雄鱼与所述杂合子雌鱼进行杂交，由此得到高伪雄群体，规模化扩大伪雄鱼亲本种群的数量；

所述性类固醇激素合成通路的催化酶编码基因为cyp17a1催化酶编码基因；

包括如下步骤：

S1，利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因，获得F0代；

S2，将F0代雄鱼与野生型雌鱼进行杂交，获得有效突变的F1代cyp17a1杂合子鱼，其基因型为cyp17a1+/-；

S3，将所述F1代cyp17a1杂合子鱼进行自交，获得F2代；

S4，在所述F2代中，筛选无雄性标记的、XX性别遗传型的cyp17a1纯合子鱼，其表现为生理雄性，记为伪雄鱼，基因型为cyp17a1-/- XX；

S5，将基因型为cyp17a1+/- XX的杂合子雌鱼和基因型为cyp17a1-/- XX的所述伪雄鱼进行杂交；

S6，经过人工催产和授精后获得F3代高伪雄群体，其中F3代雄鱼全部是基因型为cyp17a1-/- XX的伪雄鱼，由此规模化获得伪雄鱼亲本种群。

2.根据权利要求1所述的规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法，其特征在于：在步骤S6中，所述F3代雄鱼占F3代群体总数的50%，所述F3代雄鱼的筛选方法为：在F3代群体中通过腹部挤压出白色精液的个体，即可判断为F3代雄鱼。

3.根据权利要求1所述的一种规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法，其特征在于：所述基因编辑技术为采用CRISPR/Cas9系统特异性切割鱼类的cyp17a1基因，实现鱼类cyp17a1基因的敲除。

4.根据权利要求3所述的一种规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法，其特征在于：在步骤S1中，所述利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因获得F0代的具体过程为：

P1，基于CRISPR/Cas9系统，设计鱼类cyp17a1基因编辑靶位点；

P2，根据所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点设计相应的引物，并合成含有所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点的扩增片段的RNA，记为gRNA；

P3，按预定比例配制gRNA、Cas9 mRNA的注射混合物，得到cyp17a1基因编辑的注射混合物，并将所述cyp17a1基因编辑的注射混合物进行鱼类受精卵的显微注射；

P4，将注射后的鱼类受精卵养至性成熟，得到F0代。

5. 根据权利要求3所述的规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法，其特征在于：所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点位于cyp17a1基因1号外显子上，分为第一靶位点和第二靶位点，所述第一靶位点和所述第二靶位点的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。