[发明专利]一种大黄鱼卵巢组织细胞系及其应用

说明书

本申请公开了大黄鱼卵巢组织细胞系及其应用。本申请的大黄鱼卵巢组织细胞系为大黄鱼卵巢组织细胞系LYCO，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202117。本申请的大黄鱼卵巢组织细胞系，细胞性状优良，以长纤维状细胞为主，易消化，贴壁率好，耐饥饿，构建的细胞系稳定性好。本发明填补了大黄鱼卵巢组织细胞系研究的空白，为大黄鱼性腺发育机制研究提供了一种新的研究工具。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大黄鱼卵巢组织细胞系及其应用。

背景技术

大黄鱼（Larimichthys crocea），硬骨鱼纲，鲈形目，石首鱼科，黄鱼属，主要栖息于沿岸和近海水域的中下层，是中国近海主要经济鱼类，为中国传统“四大海产”（大黄鱼、小黄鱼、带鱼、乌贼）之一。现阶段大黄鱼养殖主产区为福建、浙江和广东。2019年福建产量186514吨，占比82.7%；浙江产量23932吨，占比10.6%；广东产量15103吨，占比6.7%。但大黄鱼亲鱼资源枯竭、种质退化、大黄鱼病害频发等因素极大的限制了大黄鱼养殖的进一步发展，因此亟需对大黄鱼病害防治、良种选育等进行研究。

建立鱼类细胞系能为鱼类病毒分离、抗病毒机制、疫苗研发、转基因技术、嵌合体组织工程等研究提供极大的便捷，且设施人力等资源要求相对活体实验低，重复性好，研究周期短。细胞培养为开展鱼类毒理、病理、遗传分析等研究提供了一个重要的体外模型。

目前从大黄鱼组织分离的细胞系仅有孙爱在2010年报道的大黄鱼成鱼的鱼鳍、吻端、脾脏三种细胞系，庄道华在2013年建立的肌肉、肝脏、脑细胞系以及2019年艾庆辉等建立的大黄鱼头肾巨噬细胞系。但关于大黄鱼卵巢组织的细胞系尚未有相关研究和报道，这极大地限制了为大黄鱼性腺发育机制的研究。因此，建立一种稳定性好的大黄鱼卵巢组织细胞系是本领域亟待解决的难题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种大黄鱼卵巢组织细胞系及其应用，解决了上述背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株大黄鱼卵巢组织细胞系，所述细胞系命名为LYCO，已于 2021年1月23日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：C202117，地址为中国武汉，武汉大学。

本发明提供的这株大黄鱼卵巢组织细胞系LYCO是通过以下方法进行构建：

S1.大黄鱼卵巢组织的获取：将7个月大，长9-11cm的大黄鱼幼鱼在含青霉素、链霉素及两性霉素B的灭菌海水（青霉素、链霉素及两性霉素B）购自索莱宝公司，该三抗的100×浓缩液含10000 U/mL青霉素、10000 μg/mL链霉素及10000 U/mL两性霉素B，配制海水时每100 mL海水加入1 mL三抗的100 ×浓缩液）中暂养1-1.5h，然后滴入占灭菌海水体积0.005 - 0.015%的丁香酚，直至鱼体翻转，腹部朝上，对刺激应激无反应为止；以灭菌纱布块擦除鱼体表面粘液，再以浸有酒精的纱布擦拭鱼体表面后，取出大黄鱼卵巢组织并置于含青霉素、链霉素及两性霉素B的PBS液（100 mL PBS液加入1 mL三抗的100×浓缩液）中；

S2.原代培养：将上述大黄鱼卵巢组织切碎至1.0 mm³的小组织块，以PBS溶液漂洗，三次。漂洗后将上述小组织块转移至15mL离心管中，使用0.25%胰酶消化法获得单细胞，并利用70 μm细胞过滤筛过滤消化的细胞，转移至15 mL离心管中，收集细胞沉淀，用5 mL完全培养液重悬细胞后接种于细胞培养瓶中，于27℃恒温培养启动原代培养，每2-3天更换完全培养液一次；

S3.传代培养：原代培养至贴壁细胞增殖至至少80-90%覆盖率时，移除旧培养液,并清洗去除残留的血清和二价金属离子；然后以0.25%胰酶消化法传代悬起细胞，以1:2-10进行传代；以后每隔2-3天传代一次，直至230天，60代，所述大黄鱼卵巢细胞系建立成功。