[发明专利]一种突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用

说明书

本发明属于Taq酶技术领域，公开了一种突变型Taq DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了所述的突变型Taq DNA聚合酶在PCR扩增反应中的应用。本发明的突变型Taq DNA聚合酶，其灵敏度高，使用本发明的高灵敏重组型Taq DNA聚合酶突变体，其从100拷贝数到10拷贝数的检出率远远高于野生型Taq酶，并且可以有效改善荧光增峰的问题。

技术领域

本发明属于Taq酶技术领域，具体地说，是关于一种突变型Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，是当今分子生物学领域最重要的工具之一。PCR可看作是生物体外的特殊DNA复制，能将微量的DNA大幅增加，这项技术可在试管内经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。对科学研究，疾病诊断以及治疗方面有着重要意义。而经过近30年的发展，医院检验科大都开始规范的开展实时荧光PCR检测项目，为患者治疗提供进一步的疾病监控及预后。

Taq DNA聚合酶是决定PCR反应效率的重要工具酶。DNA聚合酶是一类使用单链DNA作为模板来合成互补DNA链的酶。DNA聚合酶可以将游离核苷酸添加到新形成链的3’末端，使新链以5’-3’方向延伸。大多数DNA聚合酶是具有聚合酶和核酸酶外切活性的多功能蛋白质(例如，3’-5’外切核酸酶或5’-3’外切核酸酶活性)。Taq DNA聚合酶作为第一种被发现的可用于PCR反应的野生酶，已经被很多人进行了密集的改造研究，因此有很多生化和结构数据可供参考。但是一般的Taq DNA聚合酶的检测灵敏度只能达到1000个拷贝数左右，不能满足某些高灵敏的研究需求，尤其是医学检验的需要。

综上，现有的Taq DNA聚合酶存在灵敏度低下，影响检测效率，急需一种可以提升检测灵敏度的Taq DNA聚合酶，使其灵敏度提高，满足医学检验的需要

发明内容

本发明通过研究发现对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的突变型Taq DNA聚合酶的第188位、第243位、第506位和第747位氨基酸进行取代，可以有效改善荧光增峰的问题，可以提高Taq DNA聚合酶用于扩增反应的灵敏度和扩增效率。因此，本发明的第一个目的在于提供一种突变型Taq DNA聚合酶。本发明的第二个目的在于提供一种突变型Taq DNA聚合酶的制备方法。本发明的第三个目的在于提供一种突变型Taq DNA聚合酶的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种突变型Taq DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

作为本发明的第二个方面，一种突变型Taq DNA聚合酶的制备方法，其是将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的突变型Taq DNA聚合酶突变体的第188位、第243位、第506位和第747位的氨基酸D、W、W、M分别取代为K、M、R、R。

根据本发明，突变型Taq DNA聚合酶的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、基因突变，主要是定点突变；

步骤二、表达发酵，通过细菌培养产生大量Taq DNA聚合酶；

步骤三、纯化制备，通过后续蛋白纯化得到Taq DNA聚合酶。

作为本发明的第三个方面，一种如上述所述的突变型Taq DNA聚合酶在PCR扩增反应中的应用。

本发明的有益效果是：

1、本发明的突变型Taq DNA聚合酶，其灵敏度高。