[发明专利]一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌及其构建方法和应用。以枯草芽孢杆菌基因为模板，PCR扩增得纳豆激酶前导肽‑成熟肽基因片段NKt；以NKt基因片段为模板，扩增NKt₁₉₄突变片段；将NKt₁₉₄突变片段按毕赤酵母X33密码子偏好性进行优化和合成得NKt2；构建PGAPZα‑A‑NKt2，将PGAPZα‑A‑NKt2转化毕赤酵母X33构建真核表达系统的纳豆激酶重组基因工程菌株；培养纳豆激酶重组基因工程菌株，诱导纳豆激酶表达。本发明成功构建一株突变纳豆激酶重组基因工程菌LNF012及在真核系统中表达，使原核生物的纳豆激酶基因在真核生物体系中成功表达，为今后纳豆激酶大规模的应用奠定了基础。

技术领域

本发明属于基因工程领域。具体涉及一株含突变的纳豆激酶重组基因的工程菌的构建及在真核系统中表达。

本发明中所称的一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌命名为Komagataellaphaffii LNF012，已于2020年08月06日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.20498。

背景技术

纳豆激酶(Nattokinase，NK)是一种由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis varnatto)产生的碱性丝氨酸蛋白酶，经研究发现，纳豆激酶具有很好的溶解纤维蛋白(血栓的主要成分)能力。它的溶栓效果高于同类溶栓药物，且溶栓活性是纤溶酶的4倍。纳豆激酶包含三个部分，共381个氨基酸，从N端开始第1至第29个氨基酸构成信号肽，主要作用为介导蛋白质胞外分泌；第30至第106个氨基酸构成前导肽，主要起到帮助蛋白质折叠成正确的空间构象；剩余的275个氨基酸折叠构成具有活性的成熟肽。纳豆激酶具有催化三联体即Asp32、His64、Ser221，底物结合部位在Serl25、Leul26和Glyl27。近年来，研究人员对纳豆激酶的溶栓作用机理有了进一步的了解：优球蛋白是一种难以溶解的血浆蛋白质，纳豆激酶能够结合到优球蛋白的表面，发挥催化作用，促进其溶解，间接的促进了纤维蛋白原的降解；内源纤溶酶原激活剂t-PA是一种血管内壁细胞所分泌出的能够激发纤溶酶活性的生理性激动剂，纳豆激酶能够与血管内壁细胞作用，诱导t-PA的产生，加强纤维蛋白的降解效果；纳豆激酶可激活尿激酶原生成尿激酶，激活后的尿激酶可以溶解血栓，和纳豆激酶共同作用于血栓溶解；纤溶酶原激活剂的抑制剂(PAI-1)能够使t-PA失去活性并抑制其产生，纳豆激酶能够直接作用于PAI-1使其降解，保持t-PA的活性，使血栓溶解。目前市面纳豆激酶多用于保健类产品。纳豆激酶与其他同类的溶栓药物产品相比，如尿激酶、链激酶等产品同样具有安全性高、生产成本低等的优势，因而在市场上具有强大的竞争力和市场前景。鉴于纳豆激酶功效及发展前景，急需构建一株全新的纳豆激酶工程表达菌。

发明内容

本发明的目的是构建一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌Komagataellaphaffii LNF012及在真核系统中表达。

本发明采用的技术方案是：一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌，所述含突变纳豆激酶重组基因的工程菌命名为Komagataella phaffii LNF012，于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.20498。

一株含突变纳豆激酶重组基因的工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1)获得纳豆激酶前导肽-成熟肽基因片段NKt：以枯草芽孢杆菌DNA为模板，以Primer1和Primer 2为引物，通过PCR方法扩增出NKt基因片段；

NKt基因片段引物序列为：

Primer1：5’-GCGGAATTCGGCCGGAAAAAGCAGTAC-3’

Primer2：5’-GCGCTCGAGTTGTGCAGCTGCTTGTAC-3