[发明专利]一种基于苯并噻唑酚-半花菁体系的荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种基于苯并噻唑酚‑半花菁体系的荧光探针及其制备方法和应用，属于荧光探针检测技术领域。本发明提供了一种基于苯并噻唑酚‑半花菁体系的荧光探针，该荧光探针具有较强的灵敏度和选择性、响应速度快、较宽的线性检测范围(pH 3.0‑10.0)以及合适的pK_a值(7.92)，该探针可在裸眼比色下对待测物的pH进行半定量，可以用于高通量大样本的检测；并且其具有良好的生物相容性、细胞毒性低，还可用于线粒体pH值的实时监测，在由线粒体pH异常导致的各种病理过程中具有潜在、广阔的应用前景；本发明还提供了该荧光探针的制备方法，具有反应条件温和、后处理方便、收率高、成本低等优点。

技术领域

本发明属于荧光探针检测技术领域，具体涉及一种基于苯并噻唑酚-半花菁体系的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

线粒体是重要的能量供应细胞器，在细胞代谢中发挥重要作用，包括能量产生、细胞活性氧(ROS)产生、钙调节、氧化还原信号传导、细胞凋亡触发等。线粒体的特定pH值也与其功能密切相关，并直接影响所有的生化过程，因此其在生理条件下维持一个碱性基质(pH～8)，当质子穿过内膜时，提供一个质子动力(ψ_H⁺)，驱动通过H⁺-ATP合酶产生ATP，离子和代谢产物进入线粒体；同时，质子动力可以进一步调节Na⁺/K⁺/Ca²⁺稳态，进而调节脱氢酶活性，与ATP合酶、腺嘌呤核苷酸转位酶和三羧酸(TCA)循环结合。当线粒体pH值遭到破坏时，在线粒体中则会产生过量的活性氧，其可进一步诱导线粒体自噬、凋亡和酸化。更重要的是，线粒体自噬导致的pH异常与各种病理状况密切相关，包括神经代谢性疾病、心血管疾病、雷氏综合征等。因此，迫切需要开发一种能够实时定量检测线粒体pH变化的方法来阐明线粒体相关的生理和病理过程。

荧光分析方法由于其优异的灵敏度、高选择性和空间分辨率，已经成为一种优秀的检测技术，在现代生物分析和实时生物成像线粒体pH中越来越受到关注。为了靶向定位检测线粒体内的pH，人们早期开发了绿色荧光蛋白(GFP)突变体。然而此方法存在各种干扰因素，如不恰当的蛋白表达和错误折叠成非荧光状态，可导致结果不准确。与之相反，小分子荧光探针由于受到生物体的干扰较少，更容易应用于活细胞的检测；并且，与采用单一探测窗口的强度荧光探针相比，比率荧光探针通过对两个发射波段的自校准，具有准确、定量的测量效果。然后迄今为止，鲜有比率荧光探针用于监测线粒体pH值，而且这些探针的pKa值大多在酸性/中性(6.2-7.4)范围，远不是检测线粒体pH值(pH～8.0)的理想范围。

因此，需要进一步研究开发一种新的荧光探针用于线粒体pH检测。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于苯并噻唑酚-半花菁体系的荧光探针；本发明的目的之二在于提供一种基于苯并噻唑酚-半花菁体系的荧光探针的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种基于苯并噻唑酚-半花菁体系的荧光探针在检测pH方面的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种基于苯并噻唑酚-半花菁体系的荧光探针，所述荧光探针的化学结构式如下所示：

2.上述荧光探针的制备方法，所述合成的路线为：

优选的，所述合成的具体方法包括如下步骤：

(1)将苯并噻唑苯酚和六亚甲基四胺按照1:1～1.2的物质的量之比混合，加入三氟乙酸使其溶解，在油浴中搅拌回流6h，冷却后调节pH至中性，减压抽滤后用饱和食盐水洗涤，再通过硅胶柱层析法纯化得到化合物2；

(2)将化合物2和半花菁衍生物溶解在乙醇中，然后滴加哌啶，油浴中混合搅拌回流；