[发明专利]一种检测口腔癌DNA的拉曼光谱传感器

权利要求书

1.一种检测口腔癌DNA的拉曼光谱传感器，其特征在于：所述拉曼光谱传感器包括金盘热电极，捕获探针cDNA，信号探针sDNA和信号分子4-MBA组装在银纳米立方块表面的SERStag及切刻内切酶Nt.BstNBI，其中：

捕获探针cDNA：

CGCGTGGACCAAAGAACGAGAGTCTTTC↓TGTTTTT–(CH₂)₆-SH；

信号探针sDNA：

GGTCCACGCGTTTTT–(CH₂)₆-SH；

所述的一种检测口腔癌DNA的拉曼光谱传感器的制备方法包括如下步骤：

（1）银纳米立方块的制备

取6 mL乙二醇于反应瓶中，150 ℃油浴加热1 h，加入100 μL 3 mM硫化钠溶液，反应8-9 min，加入1.5 mL 0.02 g/mL的PVP溶液，加入0.5 mL 0.048 g/mL的硝酸银溶液，反应10-15 min；停止反应，将反应瓶冷却，纳米粒子先用丙酮冲洗一次，离心，加入超纯水分散后离心，去除上清液，超纯水重新分散，这个步骤重复3次，最后分散在4 ml超纯水中，使其浓度为6-8 nM，制备获得银纳米粒子原液，放入4 ℃冰箱备用；

（2）SERS tag的制备

将5 μL巯基修饰的10 μM sDNA与5 μL 5 mM TCEP避光孵育1 h，二者混合液加入40 μL银纳米粒子原液中，加入含0.01 wt.% SDS的150 μL 10 mM PBS缓冲溶液，在37℃孵育过夜，加入2 μL 1 mM 4-MBA溶液，孵育2 h，溶液水洗离心3次，去除上清液，最后分散在200 μL 0.01 M PBSS缓冲液中，得到AgNCs/sDNA/4-MBA，即SERS tag；

（3）SERS传感器的制备

热电极HAuE依次用1 μm和0.05 μm Al₂O₃粉在抛光布上打磨抛光，然后在超纯水中超声清洗1 min，随后HAuE在0.5 M H₂SO₄溶液中扫CV进行电化学清洗，然后超纯水冲洗电极，用氮气吹干电极表面；

cDNA固定在电极之前，10 μM cDNA用10 mM TCEP等比例混合避光处理1 h，加入0.01MPBS缓冲溶液稀释cDNA至1 μM，取15 μL 1 μM处理好的cDNA溶液滴在清洁过的HAuE表面，室温孵育2 h，得到HAuE/cDNA；用0.01 M PBS缓冲液冲洗电极，浸入200 μL 2 mM MCH溶液中室温封闭2 h，得到HAuE/cDNA/MCH；用0.01 M PBS缓冲液冲洗电极，浸入200 μL 1wt.%的BSA溶液中，室温修饰1 h，得到HAuE/cDNA/MCH/BSA；用0.01 M PBS缓冲液冲洗电极，氮气吹干电极表面，滴15 μL不同浓度的tDNA于电极表面，37℃烘箱孵育1 h，得到HAuE/cDNA/MCH/BSA/tDNA；用0.01 M PBS缓冲液冲洗电极，氮气吹干电极表面，滴15 μL步骤（2）制备的SERStag溶液，37℃孵育2 h，得到HAuE/cDNA/MCH/BSA/tDNA/AgNCs/sDNA/4-MBA；超纯水冲洗电极，氮气吹干表面，进行拉曼测定，得到酶切前初始拉曼信号I₀；

将检测之后的HAuE/cDNA/MCH/BSA/tDNA/AgNCs/sDNA/4-MBA浸泡在200 μL含有200unit/mL Nt.BstNBI的1×NEBuffer 3.1溶液中，45℃加热1 h进行酶切循环反应；将酶切后的电极用超纯水冲洗，氮气吹干，进行拉曼检测，得到酶切后拉曼信号I_f，得到初始拉曼信号I₀与酶切后拉曼信号I_f差值为∆I；

所述tDNA序列为CAGAAAGACTCTCGTTCTTT。