[发明专利]一种诱导肺类器官的方法及实验模型的建立

权利要求书

1.一种体外诱导肺类器官的方法，其特征在于，包括：

将mTmG转基因小鼠和Shh-Cre转基因小鼠交配，获得mTmG；；Shh-Cre基因型小鼠，该小鼠肺上皮细胞表达GFP绿色荧光蛋白，肺间质细胞表达红色Tomato蛋白；

取mTmG；；Shh-Cre小鼠肺组织，用胶原酶IV消化处理后，通过流式细胞仪分选肺上皮细胞和间质细胞；

将流式细胞仪分选后的肺间质细胞在Transwell的下层小室进行2D培养；

将流式细胞仪分选后肺上皮细胞在Transwell的上层小室进行3D培养，所述3D培养条件是以50％Matril胶做基质；

间质细胞和上皮细胞在Transwell中共同培养，体外建立一个类似于体内肺脏的结构和环境，培养6-9天后，使肺上皮细胞培养形成肺类器官；

间质细胞的培养条件为：在100ng/ml I型鼠尾胶原包被的培养皿上培养，每2天更换培养基，培养5天后加入细胞丝裂霉素C终止细胞扩增；培养所用培养基为肺间质细胞培养基；

肺间质细胞培养基包括DMEM，FBS，青链霉素混合液，Primocin^TM，所述肺间质细胞培养基中各成分浓度为：DMEM 89％，FBS 10％，青链霉素混合液1％，Primocin^TM 100μg/mL；

上皮细胞的培养方法是：将流式细胞仪分选的上皮细胞加入培养基中重悬并吹打成单细胞，形成的单细胞悬液与Matril胶在冰上混合均匀，使其终浓度为50％；继而将细胞-Matril胶-培养基混合液加入到Transwell上层小室中，37℃静置20分钟，待Matril胶凝固后加入培养基；其中，所述肺上皮细胞培养基包括：Advanced DMEM/F-12，青链霉素混合液，GlutaMAX，NaHCO3，HEPES，Primocin TM，FBS，EGF；所述肺上皮细胞培养基中各成分浓度为：Advanced DMEM/F-1294％，青链霉素混合液1％，GlutaMAX 4mM，NaHCO3 3.6mM，HEPES15mM，PrimocinTM 100μg/mL，FBS 5％，EGF 25ng/mL。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用mTmG转基因小鼠和Shh-Cre转基因小鼠交配产生的后代中既含有mTmG，又含有Shh-Cre的小鼠，该基因型小鼠通过PCR鉴定。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将肺组织剪成1mm³的小块，然后加入终浓度为0.1％的胶原酶IV，消化条件为37℃，45分钟。

4.如权利要求1所述的方法，培养液更换方法为：每两天更换培养基，每次用新配制的细胞培养基更换一半体积的原有培养液；培养条件为：37℃，5％CO₂浓度。

5.一种利用权利要求1-4所述的方法得到的实验模型，其为具有空腔支气管结构以及含有肺基底上皮细胞的小鼠肺类器官。

6.一种利用权利要求1-4所述的方法获得的小鼠肺类器官或权利要求5所述的实验模型用于肺脏发育、药物筛选、药物作用的机制研究的用途。