[发明专利]一种可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT提取和分析方法

权利要求书

1.一种可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的提取方法，其特征在于：该可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的提取方法包括如下步骤：

S1：将走马胎植株风干磨成粉，通过过滤器过滤；

S2：将粗粉加入乙醇中，室温浸泡一周；

S3：采用旋转蒸发法制备走马胎粉乙醇提取物，重复三次；

S4：取适量乙醇提取物用纯水稀释，用等体积的乙酸乙酯反复萃取样品，直到乙酸乙酯层无色为止；

S5：取乙酸乙酯部分，以硅胶、MCI凝胶、nmsil50-100C18为填料，各种有机溶剂为流动相，按相溶规则分离化合物，提取HEMXT提取物。

2.根据权利要求1所述的一种可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的提取方法，其特征在于：所述步骤S1中的过滤器为400目过滤器。

3.根据权利要求1所述的一种可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的提取方法，其特征在于：所述步骤S3中的蒸发温度为60℃。

4.一种如权利要求1所述的可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的分析方法，其特征在于：该可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的分析方法包括如下步骤：

A1：细胞增殖实验：将细胞以胰蛋白酶室温消化后，用培养液配成单细胞悬液，将细胞接种于培养板中，继续培养于细胞培养箱，往细胞培养液内加入HEMXT，培养3天后，弃去细胞培养液，再加入检测试剂，继续培养2h后，置光栅型连续波长酶标仪，读取各孔的吸光值；

A2：动物水平在体瘤抑制实验：对裸鼠注射癌细胞，继续饲养，待成瘤后用于实验，在肿瘤组织附近每隔一段时间注射HEMXT水溶液，一段时间后，处死小鼠，取出肿瘤组织，用多聚甲醛-蔗糖溶液固定一段时间，然后冰冻切片，用Tunnel试剂盒对肿瘤切片染色，计算各组肿瘤切片内发荧光细胞的个数；

A3：细胞周期实验：将细胞以胰蛋白酶室温消化后，接种到培养皿中，置于孵育箱中培养一段时间后收集细胞，采用冰冻乙醇固定保存，用PBS洗去固定液，加入染液，避光孵育一段时间，染色后筛网过滤，用流式细胞仪检测，用专用软件进行测定与分析；

A4：克隆形成实验：将细胞以胰蛋白酶室温消化后，用培养液配成单细胞悬液，接种于培养板中，继续培养于细胞培养箱，培养一段时间后终止实验后弃去上清液，用PBS小心浸洗，加多聚甲醛固定一段时间后，弃去固定液，加入结晶紫染色液染色一段时间后，洗去染色液，空气干燥，拍摄图像；

A5：凋亡相关因子检测：取各组细胞或肿瘤，用RIPA裂解液提取细胞或组织总蛋白，测定浓度后加上样缓冲液煮沸5min，然后SDS-PAGE，用抗体标记检测各组Caspase3、8、9以及BCL-2，Bax的表达差异；

A6：葡萄糖摄取实验：将癌细胞置于含有葡萄糖的DMEM中，细胞用KRPH缓冲液处理，通过与脱氧葡萄糖一起温育，测定葡萄糖摄取，一段时间后，用PBS洗涤细胞三次，停止反应，然后将细胞在TritonX-100中溶解，并将等分试样进行闪烁计数和Bradford蛋白质测定；

A7：乳酸产量及葡萄糖消耗实验：将细胞在不含酚红的DMEM中培养一段时间，收集培养基用于乳酸或葡萄糖测量，使用乳酸测定试剂盒进行乳酸检测，使用葡萄糖测定试剂盒测定葡萄糖水平。

5.根据权利要求4所述的一种可降糖抗癌的走马胎单体HEMXT的分析方法，其特征在于：所述步骤A1中的胰蛋白酶含量为0.25％，所述培养液为含10％FBS的DMEM培养液。