[发明专利]一种表达病毒样颗粒的质体转化的转基因植物的制备方法及其在抵抗棉铃虫中的应用

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种表达病毒样颗粒的质体转化的转基因植物的制备方法及其在抵抗棉铃虫中的应用。首先构建质体转化烟草表达载体，通过质体转化得到转基因烟草，Southern Blot检测其阳性并达到同质化，之后Western blot成功检测到MS2噬菌体衣壳蛋白在烟草中高效表达。本发明的技术方案有效地提高了植物对棉铃虫的抗性，抑制了棉铃虫的生长以及化蛹，目的基因Ace1在处理组显著性下调，说明病毒样颗粒介导的RNAi的成功应用可以有效提高植物对棉铃虫的抗性。通过VLP介导的RNAi分子递送技术在植物中的成功应用为棉铃虫的防治奠定了坚实的基础，并为棉铃虫的防控提供了一种有效的途径。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种表达病毒样颗粒的质体转化的转基因植物的制备方法及其在抵抗棉铃虫中的应用。

背景技术

棉铃虫是世界性害虫，也是我国危害最大的农业害虫之一。危害超过200余种植物，现在世界上广泛使用苏云金芽孢杆菌(Bt)来防治棉铃虫，这是一种环境较为友好的防治方法。但是随着其广泛种植也带来了新的问题，例如害虫对Bt出现抗性、棉铃虫加速进化等等。基于RNAi基因沉默发展起来的抗虫技术有着序列特异性高，环境友好等优点，为害虫的治理提供了新的思路和方向。

RNAi是一种在真核生物中由dsRNA诱发的基因沉默现象，由核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成21-24nt的siRNA，接着siRNA与体内的一些AGO蛋白酶形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，进而对互补的mRNA进行切割，导致mRNA的降解，诱发基因的沉默。在害虫防治领域，RNAi技术通过抑制害虫关键基因的表达，从而影响害虫生长或者杀死害虫。该技术具有序列特异性，针对特定的靶位点，对作物和人畜无害，具有较大的应用潜力。

过去的十年中，利用植物介导的RNAi技术在棉铃虫的防治方面取得了瞩目的成就。2007年Mao等在植物细胞核中表达针对细胞色素P450基因(CYP6AE14)的dsRNA喂食棉铃虫后，检测到棉铃虫中肠中CYP6AE14基因的转录本减少并且棉铃虫生长延滞，通过植物介导的RNAi抗棉铃虫的研究中，不同课题组也报道了针对不同的靶标基因，可以抑制相应基因的表达，转基因植物对棉铃虫具有一定程度的抗性；另外，Ni等报道了通过在棉花中聚合RNAi与Bt能够进一步提高植物的抗虫性并延缓棉铃虫对Bt抗性的进化速度。

尽管植物核转基因介导的RNAi技术在虫害治理方面取得了令人瞩目的成就，但是其抗虫效果相对于利用Bt作物抗虫不太理想。其可能的原因在于：①由于昆虫缺少RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)，RNAi抗虫效果将取决于吸收dsRNA剂量，然而通过细胞核转化表达的dsRNA量不够高，不足以引起目标害虫显著的RNAi反应。②由于植物自身具有RNAi途径，植物中表达的dsRNA会被植物本身的Dicer加工成siRNA，而植物产生的siRNA对抗虫的效果不佳。因而整体上降低了抗虫效果。因此，提高杀虫dsRNA在植物的表达水平，并提高其在植物中的稳定性，将是有效提高抗虫效果的一种策略。