[发明专利]人源化IgM单克隆抗体标准物质及制备方法

权利要求书

1.一种人源化IgM单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）针对病毒抗原进行噬菌体抗体库筛选，获得达到亲和力阈值需求的IgG原型抗体；所述抗体库包括正常人天然库、病人抗体库、合成的人源抗体库及免疫动物得到的抗体库，总库容量在10⁹以上；

（2）将IgG抗体重链可变区嫁接到人源IgM重链恒定区框架上，Kappa 轻链不变，构建出与原IgG抗体配套的人源化IgM单克隆嵌合抗体；

（3）细胞悬浮培养，瞬时转染表达人源化IgM单克隆嵌合抗体，离心去除细胞收集上清液，采用Protein L亲和纯化、离子交换和分子筛分步进行分离纯化得到人源化IgM单克隆抗体的标准物质原料；

（4）对人源化IgM单克隆抗体进行纯度表征；

（5）对人源化IgM单克隆抗体进行蛋白质活性表征；

（6）对人源化IgM单克隆抗体进行结构表征，结构表征信息包括IgM单克隆抗体切去糖链后分子量测定、切去糖链还原后分子量测定、肽谱表征；

（7）对人源化IgM单抗蛋白N-糖基化修饰的糖型和含量进行测定，包括寡糖链释放、标记、液质联用分析和数据处理四个步骤，分析得到各个糖型的相对含量丰度和分子量；根据各个糖型的相对含量丰度和分子量，计算得到人源IgM单抗蛋白单个糖基化位点的糖链加权平均分子量；

（8）基于（6）和（7）的测定结果计算人源化IgM单克隆抗体的完整分子量：根据人源化IgM重链和轻链分子量以及单个糖基化位点的糖链加权平均分子量，

由以下公式计算得到人源化IgM单克隆抗体的完整分子量；

IgM亚单元的分子量（不含糖）：；

IgM抗体的分子量（不含糖）：；

IgM抗体的糖链分子量： Da；

N蛋白人源化IgM单抗蛋白的完整分子量（含糖）：；

其中：

——切去糖链还原后的IgM重链分子量，Da；

——切去糖链还原后的IgM轻链分子量，Da；

IgM亚单元含的链内二硫键对数；

IgM亚单元分子量，Da；

n——IgM抗体包含的IgM亚单元个数；

IgM抗体含的亚单元链间的二硫键对数；

IgM分子量，Da；

IgM抗体单个糖基化位点的糖链加权平均分子量，Da；

m——IgM亚单元含的糖基化位点数；

IgM抗体的糖链分子量；

IgM抗体的完整分子量；

（9）在纯度充分表征和结构确证与目标抗体序列一致的基础上，经均匀性、稳定性检验后，采用基于氨基酸分析的同位素稀释质谱法对该单克隆抗体进行标准物质定值。

2.根据权利要求1所述的人源化IgM单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，先制备IgG原型抗体，针对病毒抗原筛选2种或2种以上达到亲和力阈值需求的IgG原型抗体， 所述原型抗体需针对抗原的不同表位；所述亲和力阈值Kd10^-7。

3.根据权利要求2所述的人源化IgM单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：在所述步骤（2）之前，根据需要对获得的IgG原型抗体进行体外亲和力成熟，提高亲和力；

所述步骤（2）中，将所述亲和力成熟后IgG抗体的重链可变区嫁接克隆到人源IgM抗体的重链恒定区上，Kappa 轻链不变。

4.根据权利要求3所述的人源化IgM单克隆抗体标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，细胞悬浮培养，瞬时转染表达人源IgM抗体，离心去除细胞收集上清液，采用Protein L亲和纯化，洗脱液采用pH3.0的醋酸盐缓冲液；收集到的蛋白调节pH到7.4，用疏水混合机制填料captoMMC进行离子交换纯化，采用低盐缓冲液线性梯度洗脱；洗脱后的目的蛋白超滤浓缩后继续用分子筛Superdex200按分子量分离纯化，获得纯化后的IgM蛋白。