[发明专利]一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法

说明书

本发明公开了一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法及获得的突变菌株，具体涉及非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)的突变。具体步骤包括：制备野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液；对野生型非洲哈茨木霉进行3轮诱变；诱变菌株的筛选；优良突变株酶活稳定性的测定。通过3轮自适应诱变对菌株进行诱变处理，诱变目的性强、实用性高。本发明方法最终诱变筛选获得一株纤维素酶活显著提升(FPA提升3.17倍、CMCase提升4.77倍、pNPCase提升3.86倍、pNPGase提升2.97倍)且遗传性状稳定的突变株MEA‑12，在工业纤维素酶制剂生产中具有重要价值。

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法及其获得的突变菌株。

背景技术

纤维素在自然界中分布广泛，是最有前景的生物转化原材料之一。作为传统化石能源的理想替代品，来自纤维素类生物质的纤维燃料乙醇引起各国的关注。纤维燃料乙醇可以通过热化学方法以及生物化学方法生产。纤维素酶是将纤维素类生物质转化为可发酵糖以生产燃料乙醇的关键。此过程中使用的纤维素酶是复合酶，即含内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)，根据C1-Cx假说，上述3种纤维素酶协同作用将纤维素转化为葡萄糖。目前，已知能够产生纤维素酶的微生物有细菌、真菌、放线菌。丝状真菌与其它微生物来源相比具有更高的分泌能力而被认为是最有潜力的纤维素酶生产菌。

通过自然选育获得的丝状真菌大多酶活性较低、酶系不全，远不能满足工业生产要求，所以选育高纤维素酶产量和质量的菌株是拓展纤维素酶应用范围的根本。非定向诱变育种方法因其适用广泛、操作简单、成本低廉等优点成为微生物育种的重要途经。诱变育种技术根据所用诱变介质的不同，主要分为物理诱变和化学诱变。然而，不同诱变介质的优缺点不一，化学诱变剂的使用能大幅度提高目标菌株酶活，但所得突变株在传代过程中易发生回复突变，同样的情况也经常存在于紫外诱变过程中(光复活修复，Photoreactivation Repair)，而ARTP与重离子体此类诱变源所得突变株的遗传稳定性良好但酶活的提升幅度却不高，如何权衡突变体正向突变率与遗传稳定性是今后研究过程中的一大重点。此外，单轮诱变与多轮诱变也会影响最终诱变效果，单一诱变技术的重复处理往往会降低突变效率。

此外，针对非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)进行有效突变获得高产纤维素酶的菌株也非常困难。

发明内容

本发明的目的在于克服现有诱变技术的不足之处，提供了一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法，解决了上述背景技术中的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供了一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法，包括如下步骤：

(1)将野生型非洲哈茨木霉进行试管斜面培养；

在步骤(1)中，所述野生型非洲哈茨木霉购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号：CICC 40189；所述野生型非洲哈茨木霉试管斜面培养的条件为在28℃，培养5～7d；所述野生型非洲哈茨木霉的培养基为查氏培养基：蔗糖30.0g，NaNO₃ 3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO₄·4H₂O 0.01g，K₂HPO₄ 1.0g，琼脂15.0g，加去离子水定容至1.0L，pH6.0～6.5，121℃灭菌20min。

(2)制备野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液；