[发明专利]一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法

说明书

本发明公开了一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，一是通过反应体系充分反应，得到待测样品溶液；二是使用全波长酶标仪对待测样品溶液进行吸光度进行检测，得到样品溶液的吸光度值；三是以氯化胆碱物质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并以样品溶液的吸光度值对照标准曲线得到对应胆碱物质的量；四是通过定义酶活并通过公式计算得到酶活数据。本发明中优化了磷脂酶D酶活性测定方法，解决了现有的酶联比色法中关于底物溶解、反应条件、终止反应、以及数据取得的问题，利用该方法测定磷脂酶D的酶活性用时短、操作简便、灵敏度高、重复性好、实用性强，并且确定了反应中所用试剂组成，有望进一步开发形成商品化试剂盒。

技术领域

本发明属于酶活测定研究领域，涉及一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法。

背景技术

磷脂酶D(phospholipase D，PLD)是催化磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine；PC)生成磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)的酶，该酶属于磷脂酶超家族成员，来源广泛，自然界中许多动植物和微生物如：植物中的大豆和卷心菜、微生物中的链霉菌和酵母等都能产生少量的磷脂酶D；研究表明PS是大脑中调控细胞膜关键蛋白功能状态的磷脂，具有改善大脑机能、帮助恢复脑疲劳的功能，2010年我国已将PS列入新资源食品。

磷脂酶D酶活性的测定一般是依据其催化原理，通过测定磷脂酰胆碱水解反应生成胆碱的量，来定义磷脂酶D的酶活，生成的胆碱可直接或间接测定；其中磷脂酶D催化的机理主要是通过其磷酸二酯酶活性，使特定磷脂发生水解和转酯两种反应；在该酶催化下，磷脂酰胆碱的磷酸酯键可水解生成胆碱和磷脂酸，也可发生转酯反应生成磷脂酰丝氨酸等稀有磷脂。

上述的直接测定方法是利用色谱法定量检测目标物，需要专门的色谱分析仪器和标准品，且操作复杂、费时、费力；而间接测定方法是以胆碱为底物，发生一系列酶联反应后生成颜色物质，然后通过比色法间接测定生成的胆碱量，虽然该方法较为灵敏，但报道的反应体系、反应条件不一，计算方法模糊，重复性较差；而一些商品化试剂盒的价格普遍较高，且对样品的适应性不强，限制了其应用。

因此，研究开发一种方便、准确、高效的磷脂酶D酶活性测定方法成为必要，以酶联比色法测定磷脂酶D酶活性为研究基础，其反应原理如图7所示，在研究过程中发现如下问题：

(1)底物溶解不佳，影响结果准确性，卵磷脂是混合物，其作为底物除参与反应的磷脂酰胆碱外，还包含磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和胆碱等物质；在反应过程中选择的溶剂以及溶剂浓度都会影响底物的溶解，并且考虑到酶联反应的特殊性，需要研究溶剂在保证能完全溶解底物的同时须兼顾后续反应的发生，对体系中其它的反应物也要有较好的溶解度的问题。

(2)反应条件需要控制，上述反应原理其中包含了酸性的催化反应体系酸性和碱性的显色反应体系碱性，那么温度、PH、不同金属离子对酶活测定反应均有影响。

(3)磷脂酶D水解反应需要严格控制反应时间，因此需要及时终止反应。常见终止酶促反应方法有沸水浴、高盐失活、酶抑制剂等；沸水浴使酶失活，但同时产生钙盐沉淀，且胆碱在高热下易分解，会影响后续显色反应；酶抑制剂可以抑制酶促反应，但抑制剂的加入量无法确定，过少不能完全终止，过量又会抑制显色反应。

(4)最终酶活数据的取得，需要确定的计算公式进行，而现有的酶活定义公式无法快速、准确的计算出酶活数据，因此需要对磷脂酶D酶活性进行定义，进而标曲绘制及公式计算。

发明内容

本发明的目的在于研究建立一种酶联比色法测定磷脂酶D酶活性的优化方法，并对其测定条件、测定步骤进行优化，使得方法可复制，以及数据准确，解决酶联比色法测定中底物溶解效果差，反应条件控制不佳对反应影响大，终止反应限制不明以及数据取得准确性不高的问题，同时为开发酶活测定试剂盒形成科研雏形，并为确定且配套的试剂盒使用方法奠定科研基础。

本发明采用的技术方案如下：