[发明专利]一种天然免疫抑制基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株及应用

权利要求书

1.通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中缺失ASFV MGF-110-9L基因制备非洲猪瘟减毒病毒株的应用，其特征在于，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFVCN/GS/2018分离株，所述ASFVCN/GS/2018分离株的全基因序列如SEQ ID NO.15所示。

2.通过在基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒中缺失ASFV MGF-110-9L基因制备非洲猪瘟疫苗的应用，其特征在于，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFVCN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的全基因序列如SEQ ID NO.15所示。

3.一种基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株为ASFV MGF-110-9L基因缺失的基因Ⅱ型非洲猪病毒，所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的全基因序列如SEQ ID NO.15所示。

4.如权利要求3所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述缺失的基因片段为ASFV CN/GS/2018分离株全长序列的第11627-12499位。

5.一种非洲猪瘟减毒疫苗，其特征在于，所述非洲猪瘟减毒疫苗包括权利要求3-4任一所述的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株。

6.一种制备减毒非洲猪瘟病毒株的方法，其特征在于，所述的方法是通过基因工程手段将原始基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒株的ASFV MGF-110-9L基因序列缺失，所述ASFV MGF-110-9L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因Ⅱ型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS/2018分离株，所述ASFV CN/GS/2018分离株的全基因序列如SEQ ID NO.15所示。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述ASFV MGF-110-9L基因序列的缺失方法包括如下步骤：

(1)pX330优化；通过ClonExpress II一步法克隆法去除pX330的Cas9酶两端的核定位信号NLS，命名为pX330ΔN；

(2)设计针对ASFV MGF-110-9L基因的靶向寡核苷酸MGF1109L-gRNA-LF和MGF1 109L-gRNA-R，将寡核苷酸配对插入pX330-ΔN载体中，制备阳性克隆质粒pX330ΔN-9LL和pX330ΔN-9LR；其中，所述MGF1109L-gRNA-LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，MGF1109L-gRNA-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(3)设计ASFV MGF-110-9L基因上下游序列各1.0kb左右序列作为同源重组臂，并同时克隆入pUC19载体中，获得ASFV MGF-110-9L重组转移载体；

(4)在ASFV MGF-110-9L重组转移载体左、右臂基因序列中间插入eGFP筛选表达盒基因片段p72-eGFP-SV40poly，获得同源重组转移载体p9LLR-eGFP；

(5)将同源重组转移载体p9LLR-eGFP、pX330ΔN-9LL、pX330ΔN-9LR和rophage DNA转染试剂充分混匀，共转染至取自2-4月龄健康SPF巴马小型猪的BMDM细胞，直接感染非洲猪瘟原始毒株；

(6)病毒株筛选：利用9L-check-F/R引物对对重组病毒株筛选，获得ASFV MGF-110-9L基因序列缺失的减毒非洲猪瘟病毒株MGF-Δ9L，所述9L-check-F/R引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示。

8.根据权利要求6-7任一所述的方法制备获得的减毒非洲猪瘟病毒株。

9.如权利要求8所述的减毒非洲猪瘟病毒株在制备非洲猪瘟疫苗中的应用。