[发明专利]一种用于干扰目的基因表达的方法

说明书

本发明公开了一种用于干扰目的基因表达的方法，通过利用STTM技术使得目的基因的mRNA表达水平下调。本发明首次采用STTM技术来干扰目的基因的mRNA，使其表达水平下调，以达到干扰目的基因的目的，通过沉默编码基因，可简化实验步骤，节省实验时间，提高实验效率，降低实验成本。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于干扰目的基因表达的方法。

背景技术

基因沉默技术作为一个重要的遗传操作工具，在植物基因组功能研究和遗传改良方面有着广泛的应用。RNAi介导的基因沉默技术基本的策略是通过双链RNA(dsRNA)产生小的RNA(sRNAs)，如siRNA、ta-siRNA、miRNA等，结合RNA诱导基因沉默复合体(RNA-inducedsilencing complex，RISC)，特异性识别互补mRNA的靶序列并进行切割或翻译抑制，从而实现对靶基因转录后或翻译后调控(Agrawal et al.,2003)。自1990年RNA介导的基因沉默现象被报道后，多种植物基因沉默技术相继建立并不断革新，包括反义RNA(antisense RNA,asRNA)、发夹结构RNA(hpRNAi)、病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)、寄主诱导的基因沉默(Host-induced gene silencing，HIGS)、人工miRNA(artificial miRNA，amiRNA)和人工ta-siRNA(artificial ta-siRNA，ata-siRNA)(Waterhouse et al.,1998；Smith et al.,2000；Lu et al.,2003；Nowara et al.,2010；Schwab et al.,2006；de la Luz Gutiérrez-Nava et al.,2008)。其中，反义RNA、hpRNAi、VIGS和HIGS都是通过DCL酶加工的siRNA途径，这一过程会产生一系列序列信息不确定的siRNAs，大大降低了RNA沉默的精确度，造成脱靶现象，此外还可能会产生次级的siRNA，造成非目标基因的沉默(张晓辉等2009)。虽然人工miRNA和人工ta-siRNA等新一代的基因沉默技术在基因调控效率和调控精确性等方面具有显著优势，但针对不同的靶mRNA，也会出现设计的amiRNA沉默失败或达不到理想的效果。因此，我们需要利用多种技术进行尝试。

短串联靶模拟(Short Tandem Target Mimic，STTM)技术是一类针对内源小RNA降解或失活的工具(Yan et al.,2012)。STTM是一段根据miRNA的核酸序列人工设计相对应的互补寡聚核苷酸链，由一段48nt或88nt的间隔序列将两个miRNA靶位点序列连接起来。STTM能够特异识别并降解miRNA，此外，研究发现STTM对靶标miRNA和siRNA的降解部分依赖于小RNA降解核酸酶(small degrading nucleases，SDNs)。STTM技术能够有效破坏内源性小RNA，为植物小RNA分子的功能基因组学研究提供了强有力的工具。

但目前尚未发现利用STTM技术实现对编码基因的下调表达或沉默的研究报道。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种用于干扰目的基因表达的方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种用于干扰目的基因表达的方法，其特征在于，通过利用STTM技术使得目的基因的mRNA表达水平下调。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

通过构建含有靶标序列和STTM骨架序列的过表达载体，然后利用此过表达载体构建转化体，再利用所得转化体侵染受体植物，筛选阳性植株，获得目的基因下调表达的转基因植株，具体为：将目的基因的靶标序列(序列R)连接在STTM骨架序列两端形成合成序列，并在合成序列两端加上同源臂序列，得到同源重组序列，将同源重组序列连接到表达载体上，通过遗传转化获得目的基因下调表达的转基因植株。其中，受体植物可以为大豆、玉米、小麦、花生、苜蓿等单子叶或双子叶植物。