[发明专利]一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法

权利要求书

1.一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，其特征在于，包括以下步骤；

(1)制备质粒：优选人源蛋白中的II型和III型胶原蛋白基因螺旋区的DNA片段，利用PCR技术将DNA片段进行密码子优化和拼接重组，利用引物上加入的NcoI和Xho I的酶切位点，加入相应的限制性内切酶将基因片段切成粘性末端，并与相应酶切处理过的pET32a的表达载体共孵育，加入T4 DNA连接酶，4℃连接12小时，转化大肠杆菌DH5α；用氨苄青霉素钠-LB平板筛选挑出白斑克隆，利用分子克隆的碱裂解法或者煮沸法提取质粒，命名为为pET32a-NTOD；

(2)转化：将步骤(1)制备的质粒与毕赤酵母进行混合进行转化，获得转化后菌落；

(3)多拷贝插入重组子的筛选：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步培养，筛选转化子；

(4)发酵：将步骤(3)筛选的转化子接种后进行发酵培养获得发酵液；

(5)纯化：将步骤(4)得到的发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。

2.根据权利要求1所述的一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，其特征在于，所述纯化包括以下步骤；

(1)粗分离

将人源化胶原蛋白蛋白用沉降式离心机进行固液分离，所得上清液用0.2μm中空纤维膜进行过滤，滤出液用截留分子量为4.5-6K的超滤膜进行超滤；

(2)精细分离纯化

向步骤(1)超滤后的浓缩液中加入柠檬酸，调节浓缩液的电导率为2.05～5.85mS/cm，再用NaOH调节pH至4.52～6.15，然后通过弱阳离子交换层析柱纯化，纯化时先用流动相A洗脱，再用流动相A与流动相B体积比为90∶5的混合液洗脱，最后用流动相A与流动相B体积比为90∶10～75∶30的混合液洗脱，洗脱流速均为130～260L/min；收集流动相A与流动相B体积比为90∶10～75∶30时的洗脱液，得到纯度大于98％的人源化胶原蛋白蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述截留分子量为4.5-6K的超滤膜为中空纤维超滤膜，且超滤过程中控制超滤膜压力不高于0.1MPa。

4.根据权利要求2所述的一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述弱阳离子交换层析柱的填料为高流速琼脂糖弱阳离子交换填料，填料总离子交换量不低于0.045-0.06mmol/mL，线性流速不得高于7.5-10mL/cm。

5.根据权利要求1所述的一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，其特征在于，步骤(2)中的转化；将经过筛分后得到的正确pET32a-NTOD质粒用氨苄青霉素钠-LB平板筛选出单斑克隆，并且在5mlLB培养基中培养过夜，按照1∶100转接，在摇瓶中36.5～37.2℃之间培养至等电点为0.5～0.7之间，加入冰预冷的与毕赤酵母感受态细胞混匀，涂布在培养基板上，培养2.5～3.5天，长处菌落。

6.根据权利要求1所述的一种人源化胶原蛋白制备工艺和方法，其特征在于，步骤(3)和(4)中的筛选以及发酵；将培养完成后的菌落采用无菌转移针转移至G418浓度分别为0.45g/L、1.5g/L、2.5g/L、3.5g/L、4.5g/L、5.5g/L的YPD平板上培养，筛选后获得转化子，将筛选获得的转化子接种于培养基中，对培养基中的转化子进行震荡培养24小时，将震荡后的转化子转接于FBS培养基的发酵罐中，将pH值调节至5～7之间，培养20～24小时，将培养后的转化子转接入FBS培养基的大罐发酵，生长温度控制在28～30℃。