[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术敲除miRNA-125a的小鼠模型及构建方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas9技术构建的C57BL/6J模型小鼠，其特征在于，该模型小鼠为miRNA-125a敲除小鼠；优选的，敲除区域为pre-miRNA-125a中的一部分，包括miRNA-125a-5p及3p的一部分和茎环结构的全部，全长42bp。

2.建立miRNA-125a敲除小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)针对C57BL/6J小鼠pre-miRNA-125a，设计敲除策略，敲除区域包括：miRNA-125a-5p及3p的一部分和茎环结构的全部，全长42bp；

(2)采用CRISPR/Cas9基因编辑方法，获得F0代小鼠；

(3)将阳性F0代小鼠和野生型C57BL/6J交配、繁育，最终得到具有miRNA-125a敲除阳性纯合小鼠。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，实现42bp的片段敲除需要一对sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑方法包括分别设计和构建sgRNA1和sgRNA2，并进行体外活性测试，制备Cas9混样体系；并将两条体外转录的sgRNA与Cas9蛋白共同进行原核注射，注射后的受精卵植入母鼠子宫获得F0。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，纯化小鼠时，F0先与野生型交配，得到F1，F1再与野生型交配得到碱基序列相同的F2，同窝F2互相交配得到纯合敲除的F3。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，阳性F1代小鼠用于保种建系，不同的保种建系之间原则上不允许交配。

7.一种鉴定miRNA-125a敲除小鼠的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)剪取少量小鼠组织，提取基因组DNA；

(2)针对权利要求3中所述的敲除位点设计一对PCR扩增引物；

(3)以待检测小鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物测序验证；

优选的，(1)中所述的组织选自脚趾、尾巴或耳朵；

优选的，(2)中所述扩增引物包含sgRNA1和sgRNA2拟敲除位点；

更为优选的，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示。

8.一种对miRNA-125a敲除小鼠进行脱靶验证的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)针对权利要求3中所述的一对sgRNA，每条sgRNA选择三个预测概率较大的潜在脱靶位点，每个潜在脱靶位点设计一对PCR扩增引物；

(2)选择权利要求5中所述的纯合敲除及野生对照F3小鼠，剪取组织提取基因组DNA；

(3)以待检测小鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物测序验证；

优选的，(1)中所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：9～20所示。

9.权利要求1或2所述的模型小鼠在生殖及妊娠相关疾病研究中的应用。

10.一种基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建miRNA-125a敲除小鼠模型的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1如SEQ ID NO:1所示，所述sgRNA2如SEQ ID NO:2所示。