[发明专利]一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用

说明书

本发明公开一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用。所述基因工程菌株的构建包括以下步骤：A：将自杀质粒p19‑Mn_hal电转化导入Mn‑egtABCDE‑hisG菌株感受态，利用同源臂引物进行PCR扩增筛选，获得MnΔhal‑egtABCDE‑hisG菌株；B：将整合型质粒pMV306‑Mn_hisC‑Mn_allB1电转化导入MnΔhal‑egtABCDE‑hisG感受态，平板筛选，验证，即得。本发明通过对自身可产生麦角硫因的新金色分枝杆菌进行代谢工程改造，构建的基因工程菌株生产麦角硫因的能力相对野生型菌株提高18倍，相对出发菌株提高4.1倍，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物合成应用领域，具体涉及一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用。

技术背景

麦角硫因(Ergothioneine，EGT)，又名巯基组氨酸甜菜碱(Thiolhistidine-betaine)，学名2-巯基组氨酸三甲基内盐，是已知唯一的天然2-硫代咪唑氨基酸。EGT可由蕈类真菌、粗糙脉孢菌及蓝细菌等生物合成，但尚未发现任何动物或植物具有合成EGT的能力。EGT具有细胞氧化还原，信号转导及生物能量稳态的功能，被认为是延长健康、延缓衰老的重要因素，适当补充可显著降低罹患中老年慢性疾病和早衰的风险。异养型的人体主要依赖从日饮食中摄取麦角硫因，由转运蛋白基因SLC22A4编码合成的OCTN1蛋白介导了人体细胞对EGT的摄取。

EGT主要可经化学合成、食用真菌或菌丝体深层发酵提取法获取。然而，化学合成法收率低、污染重、成本高，食用真菌的发酵产量低，生产成本也较高，这在一定程度上限制了EGT的推广应用。在众多食用菌中，美味牛肝菌(Boletus edulis)的产量相对较高，每克干重含量约为7.27mg(Kalaras MD,Richie JP,Calcagnotto A,et al.Mushrooms:A richsource of the antioxidants ergothioneine and glutathione.Food Chemistry,2017,233,429–433.)。由于粗糙脉孢菌(Hu W,Song H,Her AS,et al.Bioinformatic andbiochemical characterizations of C-S bond formation and cleavage enzymes inthe fungus Neurospora crassa ergothioneine biosynthetic pathway.OrganicLetters,2014,16(20):5382-5385.)、蓝细菌(Pfeiffer C,Bauer T,Surek B,etal.Cyanobacteria produce high levels of ergothioneine.Food Chemistry,2011,129(4):1766–1769.)、耻垢分枝杆菌(Seebeck FP.In vitro reconstitution ofMycobacterial ergothioneine biosynthesis.Journal of the American ChemicalSociety,2010,132(19):6632-6633.)等微生物均具有合成EGT的能力，因此，利用遗传改造来开发高产EGT的基因工程菌株，是一个具有良好应用前景的技术方向。