[发明专利]一种评估NK细胞抗巨细胞病毒作用的方法

权利要求书

1.一种检测NK细胞抗巨细胞病毒作用的方法，其特征在于，所述方法包括：

检测NK细胞的抗巨细胞病毒的功能，包括：

以1×10⁵ 每孔的剂量，将MRC-5种入24孔板1号，放入37度孵箱1号培养，待细胞贴壁后，以MOI=2加入AD169病毒液，感染1h后去除病毒液，更换新鲜DMEM完全培养基过夜培养；加入1000IU/ml预刺激过夜的NK细胞，同时加入Golgi plug试剂和CD107a抗体，37度孵箱1号培养4h后收集细胞；标记所收集的细胞表面抗体CD3和CD56，固定破膜后标记细胞内因子IFN-r，使用流式分析仪检测CD107a的百分比和IFN-r分泌量；

检测NK细胞抑制巨细胞病毒扩增的功能，包括：

将AD169感染的MRC-5细胞种入24孔板2号中，并加入1000IU/ml IL-2预刺激的NK细胞，将AD169感染的MRC-5细胞与1000IU/ml IL-2预刺激的NK细胞，放入37度孵箱2号中共培养，分别在第一天，第五天收集培养上清，使用巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器检测上清液中的CMV-DNA拷贝数；

检测被NK细胞作用后的巨细胞病毒的再感染力，包括：

收集在所述检测NK细胞抑制巨细胞病毒扩增的功能中所述第五天的培养上清，并将所述培养上清加入已有预先培养贴壁有MRC-5的24孔板3号中，于37度孵箱3号中培养1小时后更换新鲜培养基；将更换培养基后的24孔板3号置于37度孵箱3号培养5 天后收集上清液，使用巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器检测该上清液中的CMV-DNA拷贝数；通过0.05% 胰蛋白酶消化通过所述孵箱培养5 天后的MRC-5，使用巨细胞病毒检测试剂盒和qPCR仪器检测MRC-5内CMV-DNA拷贝数；

检测NK细胞对巨细胞病毒的清除功能，包括：

对6-8周雌性NSG小鼠，以X线亚致死剂量进行照射后，通过尾静脉回输HCMV血清阳性的G-CSF动员的供者外周血干细胞1×10⁶ /只；2周后，向回输所述外周血干细胞的NSG小鼠，腹腔注射AD169感染的MRC-5细胞；移植后4周，过继性回输NK细胞1×10⁷ /只，并从回输NK细胞开始隔天腹腔注射50000个单位IL-2；回输NK细胞后第0天，第7天，第14天取小鼠肝，脾，肺，使用流式细胞分析仪检测NK细胞的比例，基于原位杂交法，使用HCMV DNA探针检测组织中CMV感染和清除情况。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述检测NK细胞的抗巨细胞病毒的功能中，所述NK细胞与所述MRC-5的效靶比为1~10:1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述检测NK细胞抑制巨细胞病毒扩增的功能中，所述NK细胞与所述AD169感染的MRC-5细胞的效靶比为1~10:1；

所述AD169感染的MRC-5细胞的培养过程为：向含有MRC-5培养基中，以MOI=0.5加入AD169病毒液，感染1h后去除病毒液，更换新鲜DMEM完全培养基过夜培养。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述检测NK细胞对巨细胞病毒的清除功能中，腹腔注射AD169感染的MRC-5细胞的数量为1×10⁶ /只。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于，所述NK细胞为原代NK细胞或体外扩增的NK细胞。