[发明专利]Arvcf基因敲除动物模型的构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种建立Arvcf基因敲除小鼠模型的方法及应用，所述小鼠模型是敲除了Arvcf基因中的七个外显子的小鼠，同时揭示了一种建立Arvcf基因敲除小鼠模型的方法。首先确定待敲除基因Arvcf的敲除区域，然后设计特异性的sgRNA和对应的引物并合成，再将构建好的sgRNA/Cas9载体线性化并纯化后进行体外转录，最后通过显微注射一起注射入小鼠的受精卵中，并将其移植到假孕母鼠子宫进行Arvcf基因敲除小鼠模型的建立。收集所获得的子代小鼠的尾巴并抽提DNA，使用两对引物通过两次PCR反应以及测序以确认所获得的小鼠为野生型或敲除Arvcf基因目的区域的纯合或杂合型小鼠。该基因敲除小鼠模型可用于研究ARVCF在所参与的精神类疾病中的作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种Arvcf基因敲除动物模型的构建方法及应用。

背景技术

ARVCF(Armadillo Repeat gene deleted in Velo-Cardio-Facial syndrome)基因所编码的蛋白是p120ctn连环蛋白家族的成员，其它成员还包括p120ctn，δ-catenin和p0071等。该蛋白家族在粘着连接复合物形成中起关键作用，在神经形态发生的各方面也都有重要的作用，并且该家族的成员也被发现与多种神经发育疾病相关。另外，ARVCF蛋白是钙粘蛋白-连环蛋白复合物的一部分，可能在各种细胞类型中调节钙粘蛋白介导的连接结构和细胞间粘附，ARVCF基因还被报道参与来自神经节隆起的神经元的迁移。此外，在精神类疾病的遗传学研究中，ARVCF基因还被发现与精神分裂症、吸烟成瘾等相关。

转录激活样效应因子核酸酶(Transcription activator-like effectornuclease，TALEN)技术与锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease，ZFN)是两种常见的基因组编辑工具，其可通过诱导DNA双链断裂，然后刺激非同源末端连接(Non-homologous endjoining，NHEJ)对断裂的DNA双链进行修复或在基因的特定位置通过同源重组修复(Homology-directed repair，HDR)，由此可实现对靶基因的敲除。然而，这两种基因编辑技术存在许多不足之处，比如操作繁琐费时、对细胞的毒性大、成本高昂等。

发明内容

本发明实施例的目的是提供一种基于新一代基因编辑技术建立Arvcf基因敲除小鼠模型的方法及应用，以解决现有基因编辑技术操作繁琐、成本高昂等技术问题，同时也可解决缺乏用于研究ARVCF生物学功能动物模型的问题。

根据本发明实施例的第一方面，提供一种Arvcf基因敲除动物模型的构建方法，包括：

根据小鼠Arvcf基因结构的信息，确定待敲除的区域为外显子4-10，在敲除区域的上游和下游分别设计两条sgRNA和对应的引物，所述的敲除区域上游的sgRNA和反向引物的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，所述的敲除区域下游的sgRNA和反向引物的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

使用所述的sgRNA和引物，通过线性化载体、寡核苷酸链的退火、连接、重组质粒的转化，构建sgRNA/Cas9表达载体；

将所述的sgRNA/Cas9表达载体线性化并纯化后，作为模板进行体外转录，合成sgRNA和Cas9 mRNA；

将合成的sgRNA和Cas9 mRNA一同注射进入小鼠的受精卵中，再将注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，出生的F0代小鼠包含Arvcf基因敲除的杂合子小鼠，然后通过PCR反应和测序鉴定为阳性杂合子小鼠时，该小鼠即可稳定遗传；

取被鉴定为阳性杂合子小鼠进行杂交繁育，获得Arvcf敲除的纯合子个体和野生型个体。

进一步地，使用在线的CRISPR Design工具在敲除区域的上游和下游分别设计sgRNA和对应的引物。